les感受态细胞中，冰浴30分钟，42°C30秒，冰 浴2分钟，加入200μ1S0C液体培养基，37°C震荡培养1小时，在含羧苄青霉素抗性的LB 固体平板上培养16小时，挑取单菌落，通过PCR验证和测序筛选阳性克隆。
[0046] 将阳性克隆提质粒，在冰上加入到E.coliC41(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟， 42°C30秒，冰浴2分钟，加入500μ1LB液体培养基，37°C震荡培养1小时，在含氯霉素、四 环素和羧苄西林抗性的LB固体平板上培养12小时，挑取单菌落，PCR验证筛选阳性克隆。
[0047] 最终得到了成功构建的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌 (Escherichiacoli)pCodonPlus/pRKISC/pET51b-2[4Fe4S]Fd〇
[0048] 实施例2:重组大肠杆菌高效表达2 [4Fe4S]铁氧还蛋白的应用
[0049] (1)将实施例1构建的重组大肠杆菌菌株以体积比1 %的接种量接种到含有抗生 素和铁硫源的TB培养基中，在37°C和180rpm转速条件下培养2~3小时至0D62Qnni为0. 6， 获得菌液；
[0050]其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone 12g/L，Yeast extract 24g/L，Glycerol 4ml/L，ΚΗ2Ρ04 2. 3g/L，Κ2ΗΡ04 12. 5g/L ;
[0051] 上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终 浓度为25μg/ml的羧苄西林；
[0052] 上述铁硫源配方及组分终浓度是：柠檬酸铁铵0.2-0. 3g/L，L-半胱氨酸 0· 1-0. 2g/L，柠檬酸铁 0· 18-0. 3g/L，FeS04 · 7H20 0· 25-0. 4g/L;
[0053] (2)向制得的菌液中加入终浓度为0. 5mM的IPTG，在37°C和180rpm转速下诱导 12小时，收集培养液6, 000转/分钟离心10min，获得含2 [4Fe4S]铁氧还蛋白的重组大肠 杆菌细胞；
[0054] 或再用50mM磷酸钠（pH7. 4)进行洗涤，再用相同的条件离心，重复2次，收集沉 淀的细胞放-20 °C冻存；
[0055] (3)破碎细胞，分离纯化制备2 [4Fe4S]铁氧还蛋白。
[0056]实施例3 :2[4Fe4S]铁氧还蛋白的分离纯化及活性测定。
[0057] 蛋白的纯化在厌氧操作箱中进行，用到的所有溶液均进行煮沸后脱气厌氧处理。
[0058]配制纯化所需的缓冲液：缓冲液A:Tris-HCllOOmM，NaCl150mM，DTT2mM，pH 7. 5;缓冲液B:磷酸钠Tris-HCllOOmM，NaCl150mM，DTT2mM，desthiobiotin2. 5mM，pH 7. 5;缓冲液W:磷酸钠50mM，pH7. 0。
[0059] 粗酶液的获取：将实施例2制得的冻存细胞用含10%甘油的缓冲液A重悬，采用 超声波破碎仪器进行细胞破碎，胞破碎程序是：工作时间6秒，间歇时间6秒，功率39%，总 破碎时间为50分钟。破碎完成后12, 000转/分钟离心30min，取上清液用0. 22um孔径滤 膜过滤，置于冰上作为粗酶液待纯化。
[0060]Strep柱的处理：将镍柱装在FPLC上，以缓冲液A冲洗柱子，每次冲洗5分钟，冲 洗速度为3ml/min。
[0061] 蛋白的纯化：粗酶液经过上样柱进入Strep柱中，上样速度为2ml/min。上样结束， 用缓冲液A冲洗镍柱，去除杂蛋白，这时的洗脱速度为3ml/min。然后用缓冲液B进行洗脱， 最终棕色的目的蛋白洗脱出来。
[0062] 蛋白的处理：用大小为3KDa的浓缩管将蛋白浓缩，并用缓冲液W洗涤蛋白， SDS-PAGE观察蛋白的大小及纯度，用考马斯亮蓝法测蛋白含量，用分光光度计对蛋白进行 全波长扫描。
[0063] 铁氧还蛋白的广量测定：
[0064] 通过考马斯亮蓝法测定纯化的铁氧还蛋白含量，得到铁氧还蛋白的产量为0. 7~ 3. 5mg/l培养物，其中最优诱导条件下产量为最高，达到3. 5mg/l培养物。
[0065]铁氧还蛋白的活性测定：
[0066] 氢化酶法测活性：以纯化获得的铁氧还蛋白为底物，采用分光光度法测定C.pasteurianum氢化酶催化氢气还原铁氧还蛋白的活性，测量波长为430nm，lcm石英比色 皿，充满氢气，反应体系如下：
[0067]Tris-HCl缓冲液pH7. 5 500ul
[0068] 2 [4Fe4S]型铁氧还蛋白 20ul(终浓度：0· 053mM)
[0069] 氢化酶酶液 10ul
[0070] 以氢化酶酶液起始反应，可以发现体系吸光值逐渐降低，最后趋于平缓，通过吸光 值下降的速度再根据朗伯比尔定律计算氢化酶的比活，计算公式如下：
[0071]
[0072] 上述g是每分钟吸光度变化值，
[0073]V总是总反应体系的体积，单位ml ;
[0074]Vg!是加入氢化酶酶液的体积，单位ml ;
[0075] N是氢化酶酶液的浓度，单位mg/ml ;
[0076]L是比色皿的光程，单位cm;
[0077] ε是2[4Fe4S]型铁氧还蛋白在430nm的摩尔消光系数，为13.ImM1 ·cm^
[0078] NfnAB法测活性
[0079] 以纯化获得的铁氧还蛋白为底物，采用分光光度法测定来自C.kluyveriNfnAB酶 液催化NADPH在存在NAD+情况下还原铁氧还蛋白的活力，测量波长为430nm，lcm石英比色 皿，充满氮气，反应体系如下：
[0080]
[0081] 以NfnAB酶液起始反应，可以发现体系吸光值逐渐降低，最后趋于平缓，通过吸光 值下降的速度再根据朗伯比尔定律计算氢化酶的比活，计算公式如下：
[0082]
[0083] 上述i是每分钟吸光度变化值，
[0084] 是总反应体系的体积，单位ml;
[0085] Vg|是加入NfnAB酶液的体积，单位ml;
[0086] N是NfnAB酶液的浓度，单位mg/ml;
[0087] L是比色皿的光程，单位cm;
[0088] ε是2[4Fe4S]型铁氧还蛋白在430nm的摩尔消光系数，为13.ImM1 ·cm^
[0089] 通过以上方法分别测得氢化酶的比活为24. 1 ± 2. 5U/mg，NfnAB的比活为 18. 2±0. 7U/mg。
【主权项】
1. 一株重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pET51b-2[4Fe4S]Fd，该菌株含有 2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因， 其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示；所述重组大肠杆菌是将2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因连 接入pET51b载体，制得重组质粒命名为pET51b-2 [4Fe4S]，并将制得的重组质粒转入含有 pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coliC41(DE3)中获得。2. 如权利要求书1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述2 [4Fe4S]铁氧还蛋白基因 来源于巴斯德梭菌（Clostridiumpasteurianum)DSM525〇3. 权利要求书1所述重组大肠杆菌在发酵生产2 [4Fe4S]铁氧还蛋白中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌发酵生产2 [4Fe4S]铁氧 还蛋白的方法是： (1)将重组大肠杆菌菌株以体积比1~5%的接种量接种到含有抗生素和铁硫源的TB培养基中，在37± 1°C和180±lOrpm转速条件下培养2~3小时至0D62Qnni为0. 4~0. 6,获 得菌液； 其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone12g/L，Yeastextract24g/L，Glycerol4ml/L，KH2P04 2. 3g/L，K2HP04 12. 5g/L; 上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终浓度 为25μg/ml的羧节西林； 上述铁硫源配方及组分终浓度是：柠檬酸铁铵0. 2-0. 3g/L，L-半胱氨酸0. 1-0. 2g/L， 柠檬酸铁 〇· 18-0. 3g/L，FeS04 · 7H20 0· 25-0. 4g/L; ⑵向制得的菌液中加入终浓度为〇. 5mM的IPTG，在16~37°C和180±10rpm转速下 诱导2. 5~24小时，收集培养液离心，获得含2 [4Fe4S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细胞； (3)破碎细胞，分离纯化制备2 [4Fe4S]铁氧还蛋白。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2)所述IPTG在35~37°C和180rpm 转速下诱导10~20小时。
【专利摘要】本发明公开了一株重组大肠杆菌，该菌株含有核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示的2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因，命名为大肠杆菌(Escherichia？coli)pCodonPlus/pRKISC/pET51b-2[4Fe4S]Fd，是将2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因连接入pET51b载体，制得重组质粒命名为pET51b-2[4Fe4S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli？C41(DE3)中获得。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在发酵生产2[4Fe4S]铁氧还蛋白中的应用，实验证实每升发酵培养物最终可以获得3.5mg纯化后的2[4Fe4S]铁氧还蛋白，远大于从野生菌中纯化出来的0.5mg的产量，预示本发明提供的重组大肠杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。
【IPC分类】C12N1/21, C12P21/02, C12R1/19
【公开号】CN105274042
【申请号】CN201510829200
【发明人】黄海燕, 王书宁, 胡烈杰, 许晓群, 王郡甫, 栾俊文, 苏庆红
【申请人】山东省医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月24日