2、按1%体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mlLB摇瓶中，37°C摇培3~ 4h(彡300rpm)，得到原培养物；
[0045] 3、将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0°C，分装至冰预冷的离心管（50mL)，冰 置数分钟；
[0046] 4、4°C，4000rpm离心15min回收细胞，去上清；
[0047] 5、用冰预冷的10mL0· 1M的CaCl2重悬细胞，4°C，4000rpm离心10~15min回收 细胞；
[0048] 6、重复5,用10mL0·1M的CaCl^悬细胞，冰浴lh以上；
[0049] 7、4°C，4000rpm离心 10min回收细胞；
[0050] 8、每50mL原培养物用2~3mL含15%DMS0+CaCl2来重悬，分装于1. 5mL离心管， 50~100μL每管。-80°C保藏。由此得到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。
[0051] 3. 2 转化
[0052] 取实施例2中得到的pET-28a(+) -lipaseB5质粒(λ5~1μL与50μL大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42°C水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37°C200rpm培养45min。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板， 培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-lipaseB5的大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0053] 实施例4 :脂肪酶LIPASEB5的表达和纯化
[0054] 4.1蛋白诱导
[0055] 含有pET-28a(+)-lipaseB5的大肠杆菌BL21 (DE3)在LB培养基中培养至0D6。。为 〇· 85 左右，加IPTG至浓度(λ2mM，22°C培养 18h。300mL菌液 4000rpm，4°C离心lOmin，收集 菌体，用30mL(50mM，pH7. 4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超5s，停5s，破碎lOmin 分钟，离心，收集上清。
[0056] 4. 2脂肪酶的纯化
[0057] 用镍离子亲和层析柱纯化4. 1中收集的上清，得纯化的脂肪酶LIPASEB5(见图5)， 纯化的蛋白大小约30. 5kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用20mM的咪唑洗脱5个 柱体积，45mM咪唑洗脱20~30个柱体积，最后使用0. 1~1M咪唑洗脱5个柱体积，收集中 间3. 5mL。用脱盐柱SephadeXG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。
[0058] 4. 3脂肪酶酶活测定
[0059] 脂肪酶活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制10mM的对硝基苯酚 酯；②在lmL反应体系中加入 940μLTris-HClbuffer(50mM，pH7. 5)，20μL乙醇，10μL 的脂肪酶LIPASEB5酶液（浓度为6. 21μg/mL);③于35°C下，3~5min后，405nm测定吸光 度。
[0060] 酶活单位定义：lmin内水解对硝基苯酸酯，释放1μΜ对硝基苯酸所需的酶量定义 为一个酶活单位。
[0061] 实施例5 :脂肪酶LIPASEB5的酶学性质
[0062] 5. 1水解不同长度的对硝基苯酚酯
[0063] 按照4. 3的测定条件，比较脂肪酶LIPASEB5作用不同长度酰基的对硝基苯酚酯 C2-C16,结果如图1，说明脂肪酶LIPASEB5对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链长度 的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C10,即对硝基苯酚癸酸酯。
[0064] 5. 2最适pH和pH稳定性
[0065] 配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为 50mM〇
[0066] 表2不同缓冲体系的pH
[0067]
[0068] 将4. 3中测定条件所述的缓冲液（Tris-HClbuffer)按照表2中的缓冲溶液分别 进行替换，测定重组脂肪酶LIPASEB5的酶活力，底物为对硝基苯酚癸酸酯。pH对重组脂肪 酶LIPASEB5活性的影响结果见图2,在50mM的Tris-HCLpH7. 5时，脂肪酶LIPASEB5酶活 性最高，pH值在7. 0~8. 5之间有较高的酶活性。当pH低于7或高于9时，其活性迅速降 低。脂肪酶LIPASEB5在不同pH的缓冲液处理lh后，pH在8. 0时酶活性较稳定，pH9. 5时 酶活性残余45. 70 %。而在过酸过碱条件下，酶活丧失则较为明显。
[0069] 5. 2最适温度和温度稳定性
[0070] 使用50mM的Tris-HCLpH7. 5作为缓冲液，对硝基苯酚癸酸酯作为底物，按照4. 3 中的反应体系，在不同温度下反应，测定酶活；测得脂肪酶LIPASEB5催化水解对硝基苯酚 癸酸酯反应最适温度为30°C(图3A)，在4°C处理时残余酶活力达27. 98%，在20°C酶残余 活力达到89. 48%，温度大于30°C时酶活性急剧下降。这是长期菌株低温生活对环境的一 种适应，也是低温酶的一个重要特征。根据报道确定脂肪酶LIPASEB5低温脂肪酶。
[0071] 将脂肪酶LIPASEB5于不同温度（0~60°C)预处理15-90min，于30°C下，ρΗ7· 5， Tris-HCl的缓冲溶液中，按4. 3测定方法（以对硝基苯酚癸酸酯作为底物）测定脂肪酶 LIPASEB5酶活。结果说明随着处理温度的升高，脂肪酶LIPASEB5残余酶活力逐渐下降， 当温度高于50°C时酶活性急剧降低，在60°C处理90min后，残余酶活力仍保持在20%以上 (图3B)，脂肪酶LIPASEB5具有一定的温度稳定性。
[0072] 5. 3金属离子、不同浓度的NaCl溶液对脂肪酶LIPASEB5活性的影响
[0073] 在30°C下，ρΗ7· 5, Tris-HCl的缓冲溶液中，按4. 3测定方法（以对硝基苯酚癸酸 酯作为底物），以未添加任何离子的反应体系中的酶活为100%，作为对照，以添加表3中对 应浓度的离子或不同浓度的NaCl的反应体系为处理组，测定酶活；金属离子对酶活性的影 响见表3。2mM Li+、Ca2+、Mg2+对脂肪酶LIPASEB5催化对硝基苯酚癸酸酯的活力分别达到对 照的124. 78%、128· 38%、145· 33%。当浓度达到10mM时Li+、Ca2+、Mg2+对脂肪酶LIPASEB5 酶活性影响减弱。Fe2+、Ni2+等对脂肪酶LIPASEB5均有较强的抑制作用，Cu2+、Ba2+、Zn2+、 Mn2+对酶活性影响较小。不同浓度的NaCl溶液对酶活性的影响结果如图4所示。脂肪酶 LIPASEB5在0. 1M NaCl溶液反应酶活残余103. 61%，当浓度升到0. 2M时酶活残余有所下 降但是酶活力稳定，在NaCl浓度为1M时，脂肪酶LIPASEB5酶活力残余28. 38%。说明脂肪 酶LIPASEB5是耐钠盐的脂肪酶。
[0074] 表3金属离子对脂肪酶活力的影响
[0075]
[0076] 5. 4有机溶剂、表面活性剂、变性剂及EDTA对脂肪酶LIPASEB5活性的影响
[0077] 在30°C下，pH7. 5, Tris-HCl的缓冲溶液中，按照4. 3的测定方法（以对硝基苯 酚癸酸酯作为底物），在反应体系中加入表4中所示有机溶剂使有机溶剂在反应体系中 终浓度为体积分数5%或10%，以未加入有机溶剂的反应体系中脂肪酶LIPASEB5活性 为100%作为对照。结果如表4所示，10%的乙醇、正丙醇、异丙醇和5%的仲丁醇和叔丁 醇能有效的促进脂肪酶LIPASEB5的活性，分别为：120. 71±0. 038 %、126. 4±0. 040%、 129. 33±0. 055%、119. 72±0. 005%、146. 93±0. 142%。甲醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正 辛醇、正癸醇对脂肪酶LIPASEB5活性有一定程度的抑制。所以短链的醇对脂肪酶LIPASEB5 活性有促进作用。
[0078] 在30°C下，pH7. 5，Tris-HCl的缓冲溶液中，按照4. 3的测定方法（以对硝基苯酚 癸酸酯作为底物），在反应体系中加入表5中所示表面活性剂、变性剂和EDTA，对应的终浓 度如表5中所示（其中的浓度百分数为体积分数）。结果如表5所示，添加0. 5%EDTA的脂 肪酶LIPASEB5酶活力残余10. 29±0. 61%，当EDTA浓度为1%时，脂肪酶LIPASEB5酶残余 活力为7〇· 59±〇· 01%。脂肪酶LIPASEB5的酶活力对TritonX-100、Tween_8〇、Tween_2〇、 十二烷基苯磺硫酸钠、三聚磷酸钠有稳定的耐受性，其中〇· 5%的Tween-80、Tween_20提高 酶活性分别为106. 86±0· 021%、120· 25±0· 061%，1%的TritonX-100、Tween-20提高酶 活力分别为：101. 75±0. 006%、133. 99±0. 022%。所以脂肪酶LIPASEB5对部分表面活性 剂具有一定的耐受性，脂肪酶LIPASEB5这种耐有机溶剂和比表面活性剂的特性在洗涤添 加剂领域具有潜在的应用价值。
[0079] 表4有机溶剂对脂肪酶LIPASEB5水解活力的影响 [0080]
[0081] 表5表面活性剂、变性剂、EDTA对脂肪酶LIPASEB5水解活力的影响
[0082]
【主权项】
1. 一种脂肪酶LIPASEB5,其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。2. -种编码权利要求1所述的脂肪酶LIPASEB5的脂肪酶基因lipaseB5。3. 根据权利要求2所述的脂肪酶基因lipaseB5,其特征在于，所述的脂肪酶基因 lipaseB5的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。4. 一种含有权利要求2或3所述的脂肪酶基因lipaseB5的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为ρΕΤ-28α(+) 载体。6. -种含有权利要求2或3所述的脂肪酶基因lipaseB5的基因工程菌。7. 根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌 BL21(DE3) 〇8. 权利要求1所述的脂肪酶LIPASEB5在催化酯类水解中的应用。9. 权利要求1所述的脂肪酶LIPASEB5在低温、耐受钠盐、短链醇或表面活性剂环境下 进行催化的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的短链醇为乙醇、正丙醇、异丙醇、 仲丁醇或叔丁醇；所述的表面活性剂为TritonX-100、Tween-80、Tween-20或十二烷基苯磺 硫酸钠。
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪酶LIPASEB5及其编码基因和应用。本发明从海洋放线菌(Pseudonocardia？antitumoralis)SCSIO？01299中克隆得到脂肪酶基因lipaseB5，长度为882bp其编码的脂肪酶LIPASEB5含有293个氨基酸；通过将克隆的脂肪酶基因lipaseB5在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达后，得到了重组表达的脂肪酶LIPASEB5。脂肪酶LIPASEB5作为催化剂可催化酯类水解反应，具有较好的稳定性，而且对表面活性剂及部分有机溶剂的具有很好的耐受性；可用于洗涤剂、生物医药、化妆品和精细化工等领域。
【IPC分类】C12N15/70, C12P7/64, C12N1/21, C12P7/20, C12N9/20, C12R1/19, C12N15/55
【公开号】CN105349506
【申请号】CN201510801813
【发明人】胡云峰, 曹莹莹, 邓盾, 孙爱君, 张云
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月18日