明本发明的烟曲霉LAMP引物及检测方法具有较高的特异性，可以特异地检测出烟曲霉。
[0103 ]实施例1 -4、烟曲霉的LAMP检测方法的灵敏度检测
[0104] 检测烟曲霉的LAMP检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度，方法为:将标准品质粒 稀释至0.5X108拷贝（ C〇pieS)AiL，然后再以10倍梯度（101倍、102倍、10 3倍、104倍、105倍、 106倍、10 7倍)进行稀释，再以经梯度稀释的标准品质粒为模板，使3-9号模板中标准品质粒 的浓度分别为0.5 X 101拷贝（copies)/yL、0.5X 102拷贝（copies)/yL、0.5 X 103拷贝 (copies)/yL、0.5 X 104拷贝（copies)/yL、0.5X 105拷贝（copies)/yL、0.5X 106拷贝 (copies) AxL、0.5 X 107拷贝（copies)/yL，1号模板中烟曲霉标准品质粒稀释到1拷贝 (C〇pieS)AiL，分别对本发明LAMP检测方法和普通PCR(引物为实施例2中的F和B)检测方法 的灵敏度进行检测。
[0105] 烟曲霉LAMP检测方法灵敏度的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-3中A幅（泳道M: Marker，泳道1-9分别表示：：阴性对照（水）、1拷贝（copies)/yL、0 · 5 X 101拷贝（copies)/y L、0.5X102拷贝（copies)/yL、0.5X10 3拷贝（copies)/yL、0.5X104拷贝（copies)/yL、0.5 ><105拷贝（(3〇口168)/^、0.5\106拷贝（(：(^168) /4^、0.5\107拷贝（(^^168)八^，，从图中可 以看出，本发明烟曲霉LAMP检测方法中琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏度可达1 Okopies。
[0106] 烟曲霉普通PCR检测方法灵敏度的检测结果如图1-3中B幅(泳道M :Marker，泳道1-9分别表示：阴性对照（水）、1拷贝（(3〇?丨68)/^1^、0.5\101拷贝（(3〇?丨68)/^1^、0.5\10 2拷贝 (copies)/yL、0.5 X 103拷贝（copies)/yL、0.5X 104拷贝（copies)/yL、0.5X 105拷贝 (copies)/yL、0.5X106拷贝（(3〇?168)八^、0.5\10 7拷贝（(：〇?168)八^，从图中可以看出，烟 曲霉普通PCR检测方法的灵敏度为103c 〇pieS，表明本发明烟曲霉LAMP检测方法具有较高 的灵敏度，其灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。
[0107] 实施例5、制备用于烟曲霉LAMP检测的试剂盒
[0108] 本发明提供的试剂盒包括:用于定性检测痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品 中烟曲霉的LAMP引物，包括外引物F3(SEQ ID N0:2)、B3(SEQ ID N0:3)和内引物FIP(SEQ ID N0：4)^BIP(SEQ ID N0：5)〇
[0109] 具体的，所述试剂盒包括以下用于25yL反应体系（不含模板）的试剂:将2X反应缓 冲液 12.5yL，Bst DNA(8000U/ml)聚合酶lyL，去离子水5.5yL，5pmol引物F3(SEQ ID N0:2所 示引物）lyL，5pmol引物B3(SEQ ID N0:2所示引物）lyL，40pmol引物FIP(SEQ ID N0:3所示 引物）lyL，40pmo 1引物BIP(SEQ ID NO: 5所示引物）lyL，作为阳性对照的烟曲霉标准株基因 组DNA，以及作为阴性对照的双蒸水或无菌去离子水(优选)共同包装，得到用于25yL反应体 系烟曲霉的LAMP检测试剂盒。
[0110] 该烟曲霉LAMP检测试剂盒可参考实施例1-2的方法使用。
[0111] 二、anxC4基因在烟曲霉的实时荧光定量PCR检测中的应用
[0112] 实施例2-1、设计对烟曲霉进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR引物及TaqMan 探针
[0113] 从NCBI的核酸数据库GenBank(http: //www.ncbi .nlm.nih. gov)检索获得烟曲霉 膜联蛋白31^^4基因（31^^4或4似04)的序列（661^3吐4￥598940.1)，用0嫩1&111软件进行比 对后，获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因为烟曲霉的特异性保守序列(序列表中SEQ ID N0:1， 为anxC4基因全长，它相对其他真菌和人是特异性的，因此作为检测模板）；选取烟曲霉 anxC4基因全序列为模板，用Primer Premier 5.0软件设计对烟曲霉进行实时荧光定量PCR 检测的引物及TaqMan探针，共设计出30多套引物、探针组合(部分组合参见表3)。通过敏感 性和特异性检测筛选出性能最佳的一套引物，序列如下：
[0114] 上游引物Af-A:5'-CAGTGACGTATGAGAGTC-3'（序列表中SEQIDN0:7) ;
[0115] 下游引物Af-B:5'-GGACATAACTGGACCATC-3'（序列表中SEQ ID N0:8);
[0116] TaqManProbe(AF):5'FAM-CTACTCAGATACGGACGACGAG-TAMRA 3'（序列表中SEQ ID N0：9)〇
[0117] 上述引物特异性扩增序列表SEQ ID NO: 1中自5'端第914-1071位碱基序列； TaqMan探针的5 '端标记报告荧光基团FAM，3 '端标记淬灭荧光基团TAMRA，并将探针的3 '端 进行磷酸化处理。
[0118] 表3:烟曲霉实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针组合(部分）
[0119]
[0120] 实施例2-2、用本发明的引物及TaqMan探针进行烟曲霉的实时荧光定量PCR检测
[0121] 1、提取烟曲霉的基因组DNA
[0122] 用CTAB法提取烟曲霉(ATCC1307 3)的基因组DNA，具体方法包括以下步骤：
[0123] 1)配制CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽提缓冲液(pH 8.0):称取十六烷基三甲基 溴化铵（CTAB)30g，Tris 12.12g，乙二胺四乙酸（EDTA)5.84g，氯化钠(NaCl)82g，用800mL去 离子水充分搅拌溶解，再加入100mL二硫苏糖醇(DTT)溶液，用NaOH调pH至8.0，最后定容到 1L，室温保存；
[0124] 2)配制CIA溶液:CIA饱和酚/氯仿/异戊醇25:24:1 (V/V/V)，4°C保存；
[0125] 3)向烟曲霉样本中加入600yL CTAB抽提缓冲液，振荡混匀后在65 °C下裂解(裂解 菌体释放基因组DNA)，裂解时间优选为30min，每隔lOmin充分混匀一次；
[0126] 4)将裂解液放在冰水(约0°C)中冷却，冷却时间优选为lOmin;
[0127] 5)再向裂解液中加入Cl A溶液（除去蛋白质并获得DNA) 400yL，充分混匀，4 °C、 lOOOOrpm离心5min，将水相转移到新的离心管中；
[0128] 6)加入等体积预冷的异丙醇(沉淀DNA)，颠倒混勾数次后静置5min，4°C、lOOOOrpm 离心10min;
[0129] 6)轻轻倒出上清，将离心管倒置在滤纸上排干水分，用40yL去离子水重悬DNA，放 置-20 °C备用。
[0130] 2、构建携带烟曲霉(Af)膜联蛋白anxC4基因（anxC4)的克隆质粒(实时荧光定量 PCR标准品）
[0131 ] 根据烟曲霉（Af )膜联蛋白anxC4基因（anxC4 )的核苷酸序列（GenBank : AY598940.1，序列表SEQ ID NO: 1)设计PCR扩增烟曲霉anxC4基因的引物（上游引物Af-Ι序 列：5 ' -TCGCCAAATCTTCGACCAGT-3 '，下游引物Af-2序列：5 ' -GGTCTGGCATAGCTGGGATG-3 '），用 CTAB法提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，再以烟曲霉的基因组DNA为模板，在引物Af-1 和Af-2的引导下进行PCR扩增。25yL PCR反应体系为：DNA模板2yL，2 X Taqmix(配方：Taq DNA Polymerase(recombinant)：0.05units/μL；MgC12：4mM；dNTPs(dATP,dCTP,dGTP, dTTP): 0 · 4mM) 12 · 5yL，引物Af-10 · 5yL(5pmol)，引物Af-20 · 5yL(5pmol)，无菌水9 · 5μΙ^ΡΟ? 反应条件为：先 95°C3min，然后 95°C30s，58°C30s，72°C40s，共 35 个循环，最后 72°C7min。反 应结束后，取50yL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（100V 30min)，结果如图2-1所示， 经扩增获得了长度为275bp的DNA片段，用琼脂糖DNA胶回收试剂盒(OMEGA公司）回收、纯化 PCR扩增产物，将其连接到载体PMD19-T(购自Takara公司）中，将连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得 了序列正确的烟曲霉anxC4基因（检测基因），其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示 (SEQ ID N0:6为插入到标准品质粒中的检测序列），而且烟曲霉anxC4基因成功连接入载 体PMD19-T中的431 bp位点和432bp位点之间，与预期结果相符，将携带烟曲霉anxC4基因的 重组载体命名为pMD19-T-anxC4,其标准品质粒物理图谱如图2-2所示。
[0132] 将携带pMD19-T-anxC4的阳性克隆接入LB培养基中，在37°C条件下培养15小时，培 养结束后用质粒小提试剂盒(OMEGA公司）提取质粒，得到携带烟曲霉膜联蛋白anxC4基因 (anxC4)的克隆质粒。
[0133] 用紫外分光光度计对克隆质粒准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行 10倍梯度稀释，浓度依次为1〇1、1〇 2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇 7拷贝/2以1^，作为标准品保存于-20 °C备用。
[0134]
[0135] 分子量=片段大小X660g/(mol bp)
[0136] 3、建立实时荧光定量PCR的标准曲线
[0137] 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的 对数，纵坐标代表ct值，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。
[0138] 以步骤2获得的拷贝数分别为101、102、103、104、10 5、106、107拷贝/2以1^的?]\?)19-1