H2〇2模型组（150ymol/L);③川芎 嗪（TMP)(50ymol/L)+H 2〇2 组；④化合物（I)(10ymol/L)+H2〇2 组；⑤化合物（I)(50ymol/L) + 出02组；?化合物（I) (1 〇〇μπιο 1 /L) +H2〇2 组。
[0035] 3、实验项目及检测指标
[0036] 3 · 1MTT法检测细胞活力
[0037] 将生长良好的ECV-304细胞制备成5 X104/mL的细胞悬液，按每孔100yL接种于96 孔板，置37°C，5%C02孵育24h。细胞分组及处理上。继续培养6h和12h后，每孔加入10yL MTT 溶液(终浓度〇.5mg/L)置37°C，5%⑶2培养箱孵育4h后，每孔加入100yLDMS0,静置10min后 振荡60s，30min内置酶联免疫检测仪上检测570nm处吸光度值(OD 57〇)。
[0038] 按公式：细胞损伤抑制率=(用药组0D57Q-模型组0D57Q)A正常组0D 57Q-模型组 OD570) X 100%，计算细胞损伤抑制率。
[0039] 3.2LDR释放率测定
[0040] 取生长良好的ECV-304细胞制成1 X 105/mL的细胞悬液接种于24孔板，置37°C，5% C〇2孵育24h。细胞分组及处理同上。继续培养6h和12h，收集培养上清液。PBS洗涤2次后，每 孔加入Ο · 5mL细胞裂解液（150mmol/LNaCl，150mmol/LTris-HCI，lmmol/LEDTA，1 %TritonX-100)，于4°C静置15min后振荡数分钟，10000rpm，4°C离心10min收集细胞裂解液，参照LDH试 剂盒说明书分别测定上清液和细胞裂解液中的LDH活性。
[0041 ] 按公式:LDH释放率=上清液中LDH活性/(上清液中LDH活性+细胞裂解液中LDH活 性）' X 100 %，计算LDH释放率。
[0042] 3 · 3酶生化法测定MDA含量、S0D活力、GSH-Px活力
[0043] 取生长良好的ECV-304细胞制成1 X 105/mL的细胞悬液接种于24孔板，置37°C，5% C〇2孵育24h。细胞分组及处理同上。继续培养12h，收集培养上清液。按MDA、SOD、GSH-Px检测 试剂盒说明书测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。
[0044] 4、数据处理
[0045] MicrosoftExcel自带的统计软件进行处理，实验数据以i±s表示，组间差异用t检 验。
[0046]三、结果及结论
[0047] 1、化合物（I)对H20^iECV-304细胞生存率的影响
[0048]正常活细胞线粒体能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶，可将淡黄色MTT还原成不 溶于水的蓝紫色的甲腊结晶，结晶数量与活细胞数成正比。本实验结果显示:ECV-304细胞 经H2〇 2(15〇ym〇l/L)氧化损伤6h和12h后，细胞0D值明显降低且与正常组相比具有统计学意 义(P〈0.01)，表明细胞活力下降。而化合物（I)对细胞具有保护作用，能显著抑制H 2〇2对细胞 的氧化损伤，提高存活率。作用6h，50、100μ mol/L化合物（I)对细胞损伤抑制率分别为 16.67%(?〈0.05)和28.21%(?〈0.01)。作用1211，10、50、10(^111〇1/1化合物（1)对细胞损伤抑 制率提高为24.85%(?〈0.05)，29.64%(?〈0.01)和38.47%(?〈0.01)。见表1(**卩〈 0 · OlvsNormal ;#P〈0.05，#P〈0 · 01vsH2〇2group ;AP〈0.05，^^〈0 .OlvsTMPgroup，下同）〇
[0049] 2、化合物（I)对H2〇2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响
[0050] 乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二 硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色测定反应产物可间接求出乳酸脱氢酶活力。结 果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞LDH释放率显著增高(P〈0.01)。与模型组比，化 合物（I)各组细胞LDH释放率均减少：10、50、100μπιο 1/L化合物（I)作用6h，细胞的LDH释放率 降为 20.54%(?〈0.01)和21.22%(卩〈0.01);50、10(^111〇1/1化合物（1)作用1211，细胞的0)!1释 放率降为33.64% (P〈0.01)和29.53% (P〈0.01)。化合物（I)随浓度的增加，对氧化损伤ECV-304细胞的保护作用也逐渐增强，呈现出一定的量效关系。结果见表2。
[0051 ] 3、化合物（I)对H2〇2损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响
[0052] 实验结果表明：与正常组比模型组ECV-304细胞培养液中MDA含量显著增高（P〈 〇. 〇1)。与模型组相比，10、50、100μ mol/L化合物（I)组细胞MDA生成量均明显减少，分别为 3.00±0.79nmol/mL(P〈0.05)，2.86±0.75nmol/mL(P〈0.05WP2.69±0.45nmol/mL(P〈 〇. 01)。化合物（I)各浓度组组间对照显示，随浓度的增加，化合物（I)对ECV-304细胞脂质过 氧化损伤的保护作用也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。
[0053] 实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞S0D活性显著降低(P〈0.01)。与 模型组相比，50、100μ mol/L化合物（I)均可增强ECV-304细胞的S0D活性，S0D活性分别提高 为 17.9±1.341]/111以？〈0.05)和19.25±0.811]/111以？〈0.01)。且随浓度的增加，细胞的500活 性也逐渐提高，表明化合物（I)可增强ECV-304细胞的抗氧自由作用，具一定量效关系；?ομ mol/L化合物（I)虽也可提高SOD活性，但不具有显著统计学意义。见表3。
[0054] 实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞培养液中GSH-Px活性显著降低 (P〈0.01)。与模型组相比，10、50、100μ mol/L化合物（I)组细胞GSH-Px活性均显著提高，分别 为 73.8±10.31]/111以？〈0.05)，92.2±8.51]/111以？〈0.01)和102.5±10.31]/111以？〈0.01)。且随 化合物（I)浓度的增加，ECV-304细胞的GSH-Px活性也逐渐提高，表明细胞抗氧化作用的能 力也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。
[0055] 总结:本实验采用H2〇2作为外源性自由基生成系统，能够诱导血管内皮细胞(ECV-304)氧化应激损伤，促进细胞凋亡。通过MTT法和LDH活性检测证实化合物（I )对出02氧化损 伤细胞具有保护作用；通过细胞上清液MDA含量、S0D活性、GSH-Px活性的测定，证实化合物 (I)有清除自由基和活性氧的抗氧化特性。
[0056] 表1化合物（I)对H20；^iECV-304细胞生存率的影响（又土s,n = 8)
[0057]
[0058] 表2化合物（I)对H2〇2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响（X土n = 8)
[0059]
[0060] 表3化合物（I)对H2〇2损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响（X土s，η =8)
[0061]
[0062] 实施例3
[0063] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0064] 实施例4
[0065] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0066] 实施例5
[0067] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0068] 实施例6
[0069] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0070] 实施例7
[0071] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0072] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将干燥 的桂枝粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸 乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10 %乙醇洗脱8个柱体积，再用75 %乙 醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中 75 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、20:1、12:1和1:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为20:1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烧 基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~12 个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述用乙醇热回流提取 采用的乙醇浓度为80 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备血管保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备血管保护的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的异香豆素类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的异香豆素类化合物，可以从干燥的桂枝中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物具有清除自由基和活性氧的抗氧化特性，对H2O2氧化损伤血管内皮细胞具有保护作用，可以用来开发成血管保护的药物。
【IPC分类】A61K31/343, A61P9/14, C07D307/00
【公开号】CN105693657
【申请号】CN201610017035
【发明人】王尧尧
【申请人】王尧尧
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月12日