在37 °C条件下，阳性血清的0D值随着包被时间的延长而增加，在37°C包被4h时，P值为1.824，N值 为0.051，P/N值达到最大，为35.758。因此，本试验的抗原包被的最佳温度为37°C，最佳包被 时间为4h。
[0048]表1包被条件优化试验结果
[0049]
[0050]HRP-SPA最适工作浓度及最适作用时间的确定
[00511根据已确定的最佳条件试验，将HRP-SPA的稀释度分别设为:1:8000、
[0052] 1:16000、1: 32000、1:64000、1:128000、1: 256000、1:512000，其余按常规间接 ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为HRP-SPA最佳工作浓度。
[0053]根据已确定的HRP-SPA最适工作浓度，根据其作用时间将试验分成37°C条件下 0.5h、lh、1.5h和37°C2h共4组。其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为HRP-SPA最适作用时间。
[0054]由表2可知，随着HRP-SPA稀释倍数的增加，阳性血清和阴性血清的0D值呈递减趋 势。当HRP-SPA稀释64000倍时，P值为1.264，N值为0.029，P/N最大，为43.091。本试验HRP-SPA的最佳稀释倍数为64000倍。
[0055] 表2HRP-SPA稀释倍数的选择
[0056]
[0057] 以HRP-SPA稀释64000倍进行HRP-SPA最佳反应时间试验，结果见表3。在0.5h到 1.5h之间，随着反应时间的延长，P值呈增加的趋势，反应时间为2h时，P值已趋于平缓。当 HRP-SPA反应1.5h时，P值为1.267，N值为0.032，P/N值最大，为39.594。本试验HRP-SPA的最 佳工作时间为37°C孵育1.5h。
[0058] 表3HRP-SPA反应时间的选择
[0059]
[0060] TMB显色时间的选择
[0061 ] 根据已确定的最佳条件进行试验，将显色时间设为37°C条件下5min、10min、15min和20min，其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为底物最适显色时间。
[0062] 由表4可以看出，随着显色时间的延长，P值呈先升后降的趋势，当显色15min时，P 值为1.200，_直为0.020，？/^最大，为59.975<^]\^的最佳显色时间为151^11。
[0063] 表4TMB显色时间的选择
[0064]
[0065]实施例2:特异性实验
[0066] 2.1交叉试验
[0067] 用大肠杆菌、不动杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的18h培养菌液，分别制备免 疫原，按基础免疫程序免疫小鼠，每组5只，共20只。分离血清，用建立的间接ELISA方法检 测，并设立阳性对照和林麝阴性血清对照。根据P/N值判定这四种菌的血清是否呈铜绿假单 胞菌抗体阳性。交叉试验检测结果见表5,分别含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和 不动杆菌的P/N值均小于2,判为阴性，即该方法与上述血清无交叉反应。本试验建立的间接 ELISA方法特异性较好。
[0068]表5交叉试验结果
[0069]
[0070] 表示阴性，"+"表示阳性。
[0071] 2.2阻断试验
[0072] 取Sp-Ι株阳性血清作2倍比稀释，从1:250到1:8000,共6个稀释度，将每个稀释度 的阳性血清都分为两份，一份加等体积的最佳稀释倍数的外膜蛋白，此为阻断组;另一份加 等体积的包被缓冲液，此为阻断对照组。将处理后的血清在37°C孵育1.5h后，lOOOOrpm离心 20min。阴性血清也作2倍比稀释，从1:500到1:16000,共6个稀释度。按已确定的最佳反应条 件进行试验，采用双波长法测定结果，计算阻断率。阻断率的计算方法如下：
[0073]
[0074] 阻断试验结果
[0075]由表6可以看出，血清稀释倍数一定时，阻断组的0D值显著低于阻断对照组，阻断 率在60%以上，说明外膜蛋白能阻断阳性血清与它的反应。本试验建立的间接ELISA方法特 异性较好。
[0076] 表6阻断试验
[0077]
[0078] 实施例3
[0079] 采用本发明记载的方法检测32份阳性麝血清，32份阳性麝血清为相同血清。检测 方法和实验参数步骤为:按1.5yg/mL包被外膜蛋白，包被温度和时间为37°C4h;洗涤2次后， 以5%脱脂奶粉在37°C封闭2h;洗涤3次后，加入待检血清，与外膜蛋白37°C条件下作用 1.5h;洗涤3次后，加入HRP-SPA(稀释倍数为64000倍），在37°C条件下作用1.5h;洗涤4次后 加入显色液，37°C作用15min，终止读数，其中1~16份采用第一种洗涤液洗涤，17~32份采 用第二种洗涤液进行洗涤。本次实验的检测结果如下表7。
[0080] 表7:麝血清检测结果
[0081]
[0082]
[0083]由此可见，本发明的抗体检测试剂盒具有较高的特异性，检测结果可靠，误差率 低。从表7的统计结果分析得知，采用第二种洗涤液的检测灵敏度和特异性要高于采用第一 种洗涤液，且误差率也要相对较少;说明采用第二种洗涤液时具有更优的特异性效果和可 靠性。
【主权项】
1. 一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括： 酶标板，用于提供固相载体； 包被于所述酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白； 阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标二抗以及终止液。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述阳性血清为免疫铜绿假单胞菌的家兔 血清，所述阴性血清为健康麝血清;所述洗涤液为PBST溶液，所述显色液为TMB试剂;所述酶 标二抗为HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A;所述终止液为2mol/L的硫酸溶 液。3. -种铜绿假单胞菌抗体的检测方法，包括以下步骤： 1) 、将稀释后的待检血清加入到酶标板孔内，于37°C条件下作用0.5h~1.5h，反应完毕 后加入洗涤液静置3min~lOmin，然后洗涤； 2) 、在酶标板中加入稀释后的酶标二抗HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白 A，于37°C条件下作用0.5h~l. 5h;加入洗涤液静置3min~lOmin后再洗涤； 3) 、洗涤完毕后加入显色剂反应lOmin~20min，显色反应完毕后加入终止液终止;并使 用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述待检血清的加入量为50μ!7孔~200μ L/孔。5. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述洗涤时间为3min~lOmin。6. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述酶标二抗的加入量为50μL7孔~200μ L/孔;酶标二抗的稀释度为1:64000。7. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述显色剂的加入量为50μL7孔~200μL7 孔，显示反应的温度为37°C。8. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述终止液的加入量为50μL7孔~200μL7 孔。9. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液 中含有ΚΗ2Ρ〇4 0.27g，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐温-20 0.5mL。10. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液 中含有KH2P〇4 0.27g，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐温-20 0.5mL，庆 大霉素0.02g，硫酸铵0.05g。
【专利摘要】本发明公开了一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括：酶标板、包被于酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标二抗以及终止液。同时，本发明还提供了检测方法，包括将稀释后的待检血清加入到酶标板孔内，反应完毕后加入洗涤液静置洗涤；在酶标板中加入稀释后的酶标二抗，于37℃条件下作用0.5h~3h；加入洗涤液静置3min~10min后再洗涤；洗涤完毕后加入显色剂反应10min~20min，显色反应完毕后加入终止液终止；并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。本发明的试剂盒以及检测方法，可以检测麝血清中的抗体，高效迅速，不仅具有良好的特异性，而且操作简单，成本低廉。
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/543
【公开号】CN105424929
【申请号】CN201510822442
【发明人】熊焰, 王洪永, 任佳会, 唐清山, 廖常伟, 范学华, 乔美萍
【申请人】四川夹金山逢春养殖科技有限公司, 四川农业大学, 镇坪县逢春林麝养殖有限责任公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月24日