专利名称：一种防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂。同时，本发明还涉及该菌剂的制备方法。
背景技术：
烟草赤星病(Tobacco Brown Spot Disease)是烟叶成熟后期重要的叶部病害，在各烟区普遍发生，是我国烟草的主要病害。2006 ~ 2007年全国烟草病虫害发生情况统计表明，赤星病常年发病面积在5万亩以上的有云南、贵州、四川、湖北、湖南、广东、陝西等7个省，全国常年发病面积130~180万亩，产量损失l万吨以上，产值损失达l亿元以上。'烟草赤星病是一种典型的气传病害，目前国内以保健栽培等农业措施和化学农药等防治措施为主，缺乏可供区域栽培的抗性品种；多年使用菌核净防治烟草赤星病，导致用药成本逐步攀升，防治效果渐渐减弱，病原真菌产生抗药性，防治难度加大。因此，对于烟草赤星病这种成熟期病害的防治不大适宜采用有残留的化学药剂，有必要探索生物防治等新途径。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种有效、无毒、安全、无残留、使用简便的防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂。本发明的目的还在于提供该菌剂的制备方法。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种防治烟草赤星病的菌剂，该菌剂的生产菌株分类命名为枯草芽孢杆菌(^C27/m ^/6〃/2、 ) B75,保藏编号为CGMCC No. 1700 。本发明的生产菌株枯草芽孢杆菌(^C27/M ^/6〃//s) B75,分离自云南江川烟草根际土壤，经培养性状、常规生理生化测定、以及16S rDM 全序列测定分析发现，该生防细菌为枯草芽孢杆菌C^C27/m m6〃/") 的一个新菌株B75。该菌株具有以下特征
① 在NA培养基上菌落呈土黄色，近圆形，表面干燥、起铍、不透明。 革兰氏反应为阳性，产芽孢。 ，
② 该菌株对烟草赤星病菌[J〃er/ ar/a a〃er/2a" (fires) Keiler] 有显著抑制作用，抑菌圈直径为26.0~32.0mm;代谢粗提物抑菌圈直径为 18. 0~24. 0 mm。
③ 具有以下生理生化特征不能厌氧生长，能在50'C、 pH5. 7、 7%NaCl 下生长；接触酶阳性，氧化酶阳性，VP试验阳性；水解淀粉，液化明胶， 分解酪素，硝酸盐还原为亚硝酸盐；利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘
露醇均能产酸，不能利用葡萄糖产气；利用柠檬酸盐。
④ 该菌株的16SrDNA序列全长共1421bp,与h"6〃/" ( AY030331 ). 的相似性达到了 99.8%。
制备所述防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂的方法，包括以下步骤
1. 试管种培养
试管斜面培养基配方为牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g, 琼脂17 20g,蒸馏水1000ml， pH6. 8~7. 2。
将枯草芽孢杆菌(勘c/7/w卯6〃/h) B75移到试管斜面培养基上，
在30t:土ix:恒温培养i 2天，获得试管种。
2. 摇瓶液体发酵培养
液体发酵培养基配方为大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母贵2g、 甘露糖2g、硝酸钾lg、硫酸铵lg、自来水1000ml、 pH6. 4~6. 8 。
将每支试管斜面加无菌水5 lGml，用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细 菌悬液，以0.5%的体积比接入装培养液量为30%~50%(装培养液的容积与容器的容积比)的三角瓶中，于30。C土rC恒温、180~ 220转/分钟转速振 荡培养30~36小时。 3.制剂化
根据实际需要，可将其分别制成液体发酵菌剂或者固体菌剂。
① .制备液体发酵菌剂的方法
发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿cfu /ml以 上时，加入0.5%羧甲基纤维素钠、0.2%的十二烷基磺酸纳、5%~10%的菌 核净，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15 分钟，装入塑料旋盖瓶中。得到所需的液体菌剂。
该液体发酵菌剂保质期1年，施用时需要充分搅勾，200 ~ 300倍稀释 喷雾。
② .制备固体菌剂的方法
发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿cfu /ml以 上时，加入0.5%羧甲基纤维素钠、0.2。/ 的十二烷基磺酸纳、5%~10%的菌 核净，质量比9:1硅藻土与轻质碳酸钙，混匀、打浆、喷雾干燥，制成可 湿性粉剂。得到所需的固体菌剂。'
该固态菌剂保质期2年，500 ~ 800倍稀释喷雾。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果
1. 本发明通过枯草芽孢杆菌(勘c/Z^;W卯6〃/h ) B75菌株的试管 培养、摇床扩大培养，制备为菌剂，并将其成功地应用于防治烟草赤星病， 测定表明其对烟草赤星病的防治具有显著效果。
2. 随着人类对生存环境的曰益重视，要求减少化学农药使用量的呼声曰 益高涨，对烟草安全的意识也逐步加强。本发明对降低化学农药的使用量、 减少环境污染和农药危害，克服病原抗药性，提高烟叶品质，增强烟草农田 生态系统稳定性，保障烟草产业的可持续发展，使农民增收具有重要的现实 意义和广阔的应用前景，将会在未来的竟争中占有有利的地位。保藏生物材料的说明
'本发明釆用的细菌菌株，已于2006年4月24曰在位于中国北京中关村的 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名 为枯草芽孢杆菌(勘c//7^ wW//" ) B75,保藏登记入册编号为CGMCC No. 1700。
具体实施例方式
通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发 明。但它们并不是对本发明保护范围的限定。 实施例1
一一液体发酵菌剂制备方法 (1)菌种制备
将枯草芽孢杆菌(勘C27/m m6"7") B75移到试管斜面培养基(牛 肉浸膏3g,大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g,琼脂17 20g,蒸馏水1000ml， pH6.8 7.2)上，在30'C恒温培养1 2天，获得试管种。
(2 )液体发酵
将每支试管斜面加无菌水10ml，用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细菌 悬液，以0.5%的体积比接入已灭菌冷却至30X:、装有200迈l培养液(大 豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母膏2g、甘露糖2g、硝酸钾lg、硫酸铵lg、 自来水1000ml、 pH6. 4~6. 8)的500 ml三角瓶中，于30。C恒温180 ~ 220 转/分钟转速振荡培养36小时。要求发酵后的菌液经平板计数测定含菌量， 含菌量达150亿cfu /ml以上。
(3)制剂化
加入0.5%羧甲基纤维素钠、0.2%的十二烷基磺酸纳、5%的菌核净， 高速万能粉碎机搅拌混匀:10分钟，装入250ml塑料旋盖瓶中。即得本发明的液体菌剂。
实施例2
一一固体菌剂制备方法
(1) 菌种制备同实施例1;
(2) 液体发酵同实施例1;
(3) 制剂化
加入0.5%羧甲基纤维素钠、0.2%的十二烷基磺酸纳、5%~10%的菌核 净，质量比9:1硅藻土与轻质碳酸每，混匀、打浆、喷雾干燥，制成可湿 性粉剂。按100g/袋装入塑或铝塑封袋中。其包装应经过严格的检验，符合 可湿性粉剂农药的包装标准。
成品质量指标测定含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照囯 家企业标准(Q/KWL02-20()3 )进行，含菌量200亿/克以上，其余各项指标
均符合标准。 应用实施例
一一田间小区防治烟草赤星病试验 1.材料与方法 1.1供试材料
供试药剂实施例2所得可湿性粉剂，釆用生防菌株B75 (中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCCNo. 1700);对照药 剂菌核净(浙江生产)。'
供试烟草品种为K326。 1.2方法
对小区自然发病烟株的防效测定，在云南省红塔区研和基地试验田中进 行，共设3个处理。每个处理设l个小区，重复4次，小区随机排列，每小区植烟200株，中间、四周设保护行间隔。具体处理如下，处理A: 500倍 实施例2所得可湿性粉剂；处理B: 500倍菌核净药剂对照；处理C:清水空 白对照。3个处理均为喷施，施用时间为去脚叶后进入釆烤期时。
病情调查在施用前后均应进行，即施用当天及施用15天后调查病情。 调查时五点取样，定株定点调查，每次只需调査烟株底部往上数的6片叶。 记载标准采用烟草病害调查的行业标准YC/T 39-1996进行。统计病指，以
病指增长计算防效。 2.结果与分析
对小区自然发病烟株^防效测定结果(表l)表明，实施例2所得可湿 性粉剂对烟草赤星病的防效达80%以上，达到施用菌核净的效果。 表l.药剂对小区自然发病烟株的防效测定
_^_^_^_
第l次病指 3.24 4.05 2.86
第2次病指 5.28 6.17 15.21
防效(％)_83.48_82.83_——
注表中调查次序编号后的数据为4次重复的病指平均数。
权利要求
1、一种防治烟草赤星病的菌剂，其特征在于该菌剂的生产菌株分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B75，保藏编号为CGMCCNo.1700。
2、 根据权利要求l所述的菌剂，其特征在于，所述菌株的培养基配 方如下①试管斜面培养基配方为牛肉浸奢3g，大豆蛋白胨5g,葡萄 糖5g,琼脂17 20g和蒸馏水1000ml， pH6.8~7.2;②液体发酵培养基 配方为大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母膏2g、甘露糖2g、硝酸钾 lg、硫酸铵lg和自来水1000ml, pH6. 4~6. 8。
3、 制备权利要求1所述防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂的方法， 包括以下步骤(1)试管种培养试管斜面培养基配方为牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g,葡萄糖5g, 琼脂17 ~ 20g和蒸馏水lOOQml, pH6. 8 ~ 7. 2;将枯草芽孢杆菌(&c///^ 卯W/h'iO B75移到试管斜面培养基上，在30。C ± 1C恒温培养1 ~ 2天，获得试管种；(2 )摇瓶液体发酵培养液体发酵培养基配方为大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母奢2g、 甘露糖2g、硝酸钾lg、硫酸铵lg和自来水1000ml, pH6.4 6.8;将 每支试管斜面加无菌水5~10ml，用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细菌 悬液，以0.5%的体积比接入装培养液量为30沐~50%(装培养液的容积与 容器的容积比)的三角瓶申，于30'C土1。C恒温、180~ 220转/分钟转速 振荡培养30~36小时； (3)制剂化发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿cfu /ml以 上时，加入0.5%羧甲基纤维素钠、0.2%的十二烷基磺酸纳和5%~10%的菌 核净，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌l5分钟，得到所需的液体菌剂。
4、制备权利要求1所述防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂的方法， 包括以下步骤(1) 试管种培养试管斜面培养基配方为牛肉浸膏3g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖5g， 琼脂17 ~ 20g和蒸馏水1000ml, pH6. 8 ~ 7. 2;将枯草芽孢杆菌(勘c///^ B75移到试管斜面培养基上，在30°C ± 1C恒温培养1 ~ 2天，获得试管种；(2) 摇瓶液体发酵培养液体发酵培养基配方为大豆蛋白胨10g、蔗糖5g、酵母膏2g、 甘露糖2g、硝酸钾lg、硫酸铵lg和自来水1000ml, pH6. 4~6. 8;将 每支试管斜面加无菌水5~10ml,用接种环刮下菌苔，并摇匀形成细菌 悬液，以0.5%的体积比接入装培养液量为30%~50%(装培养液的容积与 容器的容积比)的三角瓶中，于30。C土lt:恒温、180~ 220转/分钟转速 振荡培养30~36小时；(3) 制剂化发酵后的菌液经平板计数测定含菌量，当含菌量达150亿cfu/ml以上 时，加入0.5%羧甲基纤维素钠、0.2%的十二烷基磺酸纳、5%~10%的菌核净 和质量比9:1硅藻土与轻质碳酸钙，混匀、打浆、喷雾干燥，制成的可湿性 粉剂即为所需的固体菌剂。
全文摘要
本发明公开了一种防治烟草赤星病的枯草芽孢杆菌菌剂。该菌剂的生产菌株分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B75，保藏编号为CGMCC No.1700。将该菌株移到试管斜面培养基上，在30℃±1℃恒温培养1～2天，获得试管种。再经摇瓶液体发酵培养30～36小时后制成液体发酵菌剂或者固体菌剂。实验表明，本发明菌剂用于防治烟草赤星病有很好的应用前景。
文档编号A01N63/02GK101595893SQ200910094548
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者夏振远, 宋春满, 师君丽, 方敦煌, 白江兰, 涛 逄, 雷丽萍 申请人:云南省烟草农业科学研究院