本发明涉及一种丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺。
背景技术：
丹参(salviamiltiorrhizabunge)又名赤参，紫丹参，红根等，是唇形科鼠尾草属多年生草本植物。丹参作为一传统中药在我国沿用已久，始载于《神农本草经》，被列为上品。《本草经疏》、《本草纲目》中都有记载。具有活血散淤、消肿止血、消炎止痛、调经止痛、扩张冠状动脉、改善心肌缺血状况、降低血压、安神静心、降血糖和抗菌等功效；对月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等病症有一定的疗效。此外，丹参还具有抗血小板凝聚、降低血液黏度及调节内外凝血系统的功能，是一种安全又可靠的治疗心脏血管疾病的天然中药。丹参主要含两类成分：一为脂溶性的二萜类化合物，二为水溶性的多聚酚酸类成分。
丹参的繁殖方式一般为种子繁殖和分根繁殖，种子萌发率比较低，分根繁殖出芽率及长势比较低。通过现代实验技术组织培养技术，又叫离体培养，指从丹参植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株的技术，在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
随着丹参研究的更加深入，需要进行合适的愈伤组织诱导，更好的实现组织培养技术繁殖丹参，而现有的丹参组织培养其长势、大小、颜色以及质地等都未达到最佳，并且影响后续培养的效果。
技术实现要素：
针对上述存在的问题，本发明旨在提供丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺，本发明通过优化丹参组织培养过程中愈伤组织的诱导工艺，提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地等。naa和2，4-d浓度降低，有利于愈伤组织诱导率增加，培养条件优化，愈伤组织增值生长旺盛，整体愈伤组织诱导技术工艺优化，使得诱导出的愈伤组织质地紧密，颜色黄绿色，用来转接继代培养比较适合。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺，包括以下步骤：
1)外植体取样：取丹参嫩幼叶片，进行筛分，通过清洗设备对丹参嫩幼叶片进行清理，后用纯水冲洗干净；
2)外植体消毒：冲洗干净的外植体放置于75％酒精中浸泡10-20s，匀速震荡，接着转入无菌水中冲洗3次，再用0.1％升汞浸泡消毒4-6min，过程中继续震荡，然后转入无菌水中冲洗3-5遍；
3)外植体处理：将消毒后的丹参叶片外植体放置于无菌接种盘上，用无菌解剖针固定，经无菌解剖刀片切成小碎片，避开叶柄和主叶脉；
4)外植体接种：采用无菌镊子将上述小碎片镊起，放置于ms固体培养基上，其培养基成分为ms+1.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+0.8mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8，高压灭菌；
5)外植体培养：接种后的外植体放置于培养箱中进行愈伤组织诱导，15天后开始统计愈伤组织诱导率、质地、颜色和生长情况。
作为优选，所述步骤(1)中的清洗设备包括清洗槽、进水管、出水管以及旋转清洗轴，所述旋转清洗轴设置在所述清洗槽内，在所述旋转清洗轴的外周上等间距设置若干清洗软毛刷。
作为优选，在清洗之前对清洗软毛刷进行消毒处理。
作为优选，所述步骤(3)中的经无菌解剖刀片切成0.5cm×0.5cm大小的小碎片。
作为优选，所述步骤(5)中的培养条件为：培养温度(27±0.5℃)，光照时间12-14h，光强3000-4000lx，t5植物培养灯管。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的改进在于提出丹参愈伤组织诱导工艺，以及对该诱导工艺中培养基成分以及培养条件的改进，使得通过优化丹参组织培养过程中愈伤组织的诱导工艺，提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地等。naa和2，4-d浓度降低，有利于愈伤组织诱导率增加，培养条件优化，愈伤组织增值生长旺盛，整体愈伤组织诱导技术工艺优化，使得诱导出的愈伤组织质地紧密，颜色黄绿色，用来转接继代培养比较适合。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例：，丹参组织培养中愈伤组织诱导工艺，包括以下步骤：
1)外植体取样：取丹参嫩幼叶片，进行筛分，通过清洗设备对丹参嫩幼叶片进行清理，后用纯水冲洗干净；
清洗设备包括清洗槽、进水管、出水管以及旋转清洗轴，所述旋转清洗轴设置在所述清洗槽内，在所述旋转清洗轴的外周上等间距设置若干清洗软毛刷，在清洗之前对清洗软毛刷进行消毒处理，同时也可对旋转清洗轴进行消毒处理，旋转清洗轴由电机控制旋转，在清洗槽的水平面上设置格栅，格栅的口径大小小于丹参嫩幼叶片，旋转清洗轴设置在格栅下面，格栅的一端铰接在清洗槽上，另一端可以任意上下移动，使得丹参嫩幼叶片更加方便的浸入到清洗槽内，这样在清洗的过程中就能将丹参嫩幼叶片全部浸没在水中进行清洗，而且在清洗的过程中配合软毛刷的作用使得清洗更加的彻底，为后续的无菌、无毒培养提供基础；
2)外植体消毒：冲洗干净的外植体放置于75％酒精中浸泡10-20s，过程中不断匀速震荡，增加酒精与外植体的接触面积；接着转入无菌水中冲洗3次，再用0.1％升汞浸泡消毒4-6min，过程中继续匀速震荡，然后转入无菌水中冲洗3-5遍；
现有技术是75％酒精浸泡0.5-1min，之后没有转入无菌水中，0.1％升汞浸泡消毒10-13min，消毒过程优化酒精与升汞消毒时间，降低了外植体污染和褐化的概率；
3)外植体处理：将消毒后的丹参叶片外植体放置于无菌接种盘上，用无菌解剖针固定，经无菌解剖刀片切成0.5cm×0.5cm大小的小碎片，避开叶柄和主叶脉，避开叶柄和主叶脉可以提高愈伤组织诱导的概率；
4)外植体接种：采用无菌镊子将上述小碎片镊起，放置于ms固体培养基上，其培养基成分为ms+1.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+0.8mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8，高压灭菌；培养基成分与现有的愈伤组织诱导技术有区别，是提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地的主要因素；
5)外植体培养：接种后的外植体放置于培养箱中进行愈伤组织诱导，15天后开始统计愈伤组织诱导率、质地、颜色和生长情况；培养条件：培养温度(27±0.5℃)，光照时间12h-14，光强3000-4000lx，t5植物培养灯管，培养条件优化，愈伤组织增值生长旺盛，使得诱导出的愈伤组织质地紧密，颜色黄绿色，用来转接继代培养比较适合。
与现代组织培养中愈伤组织诱导培养相比，本发明的优势在于，
本发明通过优化丹参组织培养过程中愈伤组织的诱导工艺，提高丹参外植体愈伤组织诱导速率、长势、质地等。naa和2,4-d浓度降低，有利于愈伤组织诱导率增加，培养条件优化，愈伤组织增值生长旺盛，整体愈伤组织诱导技术工艺优化，使得诱导出的愈伤组织质地紧密，颜色黄绿色，用来转接继代培养比较适合。
在具体实验过程中，本发明以丹参叶片为外植体，通过不同激素不同的浓度梯度得到愈伤形成的最佳激素浓度配比。
实验过程中，单独使用naa诱导愈伤形成，结果发现低浓度的naa(低于0.8mg/l)15天后观察发现愈伤形成速度慢，仅叶片边缘形成少量愈伤，而高浓度的naa(高于0.8mg/l)虽然能够形成完整愈伤，但是愈伤生长状况较差，且长出许多黑色不定根，不利于后期的诱导分化；
表1：不同浓度naa对丹参叶片形成愈伤的影响
上述实验证明低浓度的2,4-d(低于0.8mg/l)愈伤生长后期会长出许多透明状须根，而高浓度的2,4-d(高于0.8mg/l)15天后观察形成的愈伤褐化现象比较严重。
表2：不同浓度2,4-d对丹参叶片形成愈伤的影响
此外，为了更好达到实验效果，本发明将6-ba、naa、2,4-d组合使用形成不同浓度配比，14天后观察愈伤形成情况，结果表明6-ba浓度为1.0mg/l，naa浓度为0.8mg/l，2,4-d浓度为0.8mg/l混合使用时，形成愈伤效果最好。
表3：不同浓度激素组合对丹参叶片形成愈伤的影响
外植体培养结果：
表4：外植体愈伤组织诱导工艺优化前后培养结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。