专利名称：与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
低温胁迫是影响植物正常生长的主要障碍因子之一，植物尤其是经济作物的抗低温性强弱直接影响作物产量。目前抗冷基因的鉴定多集中于拟南芥、水稻等模式植物以及玉米和棉花等重要农作物。他们多为热带起源的植物，都不能忍受冷环境，0°c 12°C即造成伤害。因此，亟需从其它抗低温性强的植物中挖掘相关基因。我国是世界上生物多样性最丰富的国家和主要作物的起源中心之一，不仅植物遗传资源种类多，而且许多是适应恶劣极端环境的野生种，这些物种在抗寒、抗旱和耐盐碱等方面具有明显的优势，是当前和未来农业可持续发展的基础。羊草又名碱草，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。羊草为禾本科多年生草本植物，具有非常发达的地下横走根茎，根深可达1米 1.5米，主要分布在20厘米以上的土层中。羊草抗寒、抗旱，耐盐碱、耐土壤瘠薄， 适应范围很广，在土壤冻结占全年一半时间的松嫩平原生长良好。羊草与抗冷有关基因的克隆及功能分析对提高农作物和经济作物的抗低温性方面有着一定的应用价值。长期以来，人们对植物响应冷胁迫的机制已经从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度进行了很多研究，积累了丰富的知识。近年来，随着分子生物学的发展，人们进一步在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上加深了对植物抗冷机理的认识，为利用基因工程方法改良植物的抗低温性能提供了坚实的基础。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗低温性十分困难。转基因等基因工程方法为植物抗冷育种提供了有效途径，但高效抗冷基因的分离是限制植物抗冷基因工程的关键因素。植物抗低温性受多基因调控，要使众多对植物抗逆性状产生作用的功能基因协调发挥作用，才能有效改良植物抗低温性。由于一个抗冷相关转录因子可以调控多个基因的表达，因此增强一个转录因子的作用，就可使植株的抗低温性状得到综合改善。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与植物耐低温性相关的蛋白，名称为LcWRKY5，来源于羊草 (Leymus chinensis)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。序列表中序列1由3 个氨基酸残基组成。为了便于LcWRKY5的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低温性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-4) 中任一所述的基因1)序列表中序列2自5’末端起第1位到第984位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是在 P3301-121载体的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；所述P3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含⑶S基因的片段；(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接，得到重组载体P3301-121。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为重组酵母菌。
7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中， 得到耐低温能力高于所述目的植物的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中。
10.根据权利要求8或9中所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥； 所述低温为0°C或4°C。
全文摘要
本发明公开了与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物耐低温性相关的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低温性相关的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，LcWRKY5具有组织表达特异性，受低温诱导表达，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。LcWRKY5及其编码基因对于培育耐低温性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。
文档编号C12N15/63GK102477089SQ20101056579
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者刘公社, 李晓峰, 程丽琴, 赵爱国, 陈双燕, 齐冬梅 申请人:中国科学院植物研究所