专利名称：枯草芽孢杆菌ls02漆酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌漆酶，具体涉及一株枯草芽孢杆菌LS02的芽孢漆酶的制备 方法和催化性质，以及编码该芽孢漆酶的核酸片段。此外，本发明还涉及到该芽孢漆酶使合 成染料脱色的方法，属于应用微生物领域。
背景技术：
漆酶(EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化 氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶催化的底物范围十分广泛， 因此漆酶酶已被广泛应用于造纸工业、纺织工业、食品工业以及土壤的生物修复等领域。漆酶催化氧化底物一般包括两种作用方式，第一种是底物分子直接与漆酶铜簇反 应氧化成相应的激发态分子。然而有些底物不能由漆酶直接氧化，原因在于它们分子太大 而不能渗透进入酶的活性部位，或者由于其氧化还原电位较高而不能被漆酶直接氧化。漆 酶氧化底物的第二种方式是通过一些小分子的介体物质为媒介，漆酶先将小分子介体氧化 成激发态，然后这些激发态的介体再与大分子的或氧化还原电位较高的底物反应，该方式 也被称为漆酶-介体系统(LMS)。漆酶-介体系统的应用有助于进一步扩大漆酶的底物范 围，提高漆酶的工业应用范围。在自然界中，漆酶广泛分布于植物、真菌和细菌中，特别是真菌，是目前漆酶的主 要生产者。虽然目前对细菌漆酶的理论研究不如真菌漆酶深入，但细菌具有生长快、易于培 养的特点，细菌漆酶较真菌漆酶在碱性环境和高温下具有更好的稳定性。由于工业造纸废 水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中受到稳定性差的限制，因此细菌漆酶 在工业上具有更好的应用前景。漆酶在细菌中的存在主要有三种形式，即细胞外漆酶、细胞内漆酶和细胞组成漆 酶。得到的这三种形式的酶，酶的活性及稳定性不同。由于胞内酶需破壁获得，此形式的 漆酶在破胞过程中酶活性降低较明显，且随着细胞的破碎各种细胞组份与漆酶混合，对酶 的纯化也会带来困难；与之相比，另外的两种形式漆酶则优势显而易见，尤其是细胞组成漆 酶，通常是芽孢菌属的细菌，由于细菌芽孢对高温、高压、极端PH以及高盐等多种不利因素 具有较强的抗逆性，该种类漆酶会因芽孢这一特殊构造的特性而表现出更好的温度稳定性 和PH稳定性。随着分子生物学技术的不断发展，众多的漆酶基因已经得到了克隆和深入分析。 研究漆酶编码基因的表达调控机制，有助于阐明不同基因在发育进程中所起的作用，此外， 还可以通过定点诱变等技术对漆酶基因进行改造，提高漆酶工业应用性能。染料被广泛应用于纺织、印染、皮革等行业，全球每年生产染料万种之余，至少有 10-15%的染料通过废水排放到自然环境中，对水体的生态环境造成严重破坏。工业使用的 合成染料多是芳香族化合物，结构复杂，难降解。目前染料废水的处理方法主要有物理化学 法和生物处理法，物化处理技术费用高，存在二次污染，生物法因其经济环保而成为较好的 治理方法。其中漆酶由于具有广泛的底物作用范围，可催化降解多种结构的染料，在工业染料废水处理上具有较好的应用前景。已有很多关于应用白腐菌或其它真菌来源的漆酶脱色 染料的研究，但关于细菌漆酶以及细菌漆酶-介体系统在染料脱色方面的研究报道较少。 通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶的工业应用。
发明内容
本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Baciilus subtilis)LS02，同时本发明的 目的还在于提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02产芽孢漆酶的制备方法，以 及提供一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02产的芽孢漆酶脱色合成染料的方法。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02已于2010年10月22日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 4261。上述枯草芽孢杆菌菌株是从中国黑龙江省伊春市凉水国家自然保护区森林表 层土壤分离获得。枯草芽孢杆菌LS02菌株革兰氏染色阳性，芽孢中生，有鞭毛。在固体 Luria-Bertani (LB)培养基上，37°C培养Mh，菌落微黄色、扁平呈圆形，菌落表面湿润、光 滑，菌落边缘呈叶状，菌落半透明且正反颜色一致。菌株的最适生长温度为37°C，最适生长 PH 为 7.0，可耐受 -13% 的 NaCl。本发明提供了枯草芽孢杆菌LS02产芽孢漆酶的产孢培养培养基配方及芽孢漆酶 的制备方法。上述产孢培养基配方(g/L)为营养肉汤8 ；KCll ；MgSO4 · 7H20 0. 25 ；MnCl2 · 4H20 0. 002 ；琼脂17 ；调pH7. 0后高温高压灭菌，加入过滤除菌的0. 5mmol/LCaCl2及0. OOlmmol/ L FeSO40上述芽孢漆酶的制备方法为1)枯草芽孢杆菌LS02划线接种于固体产孢培养基上，37°C倒置培养5d后。2)用无菌去离子水将固体培养基上的芽孢冲洗下来。3)加入终浓度0. lmg/mL的溶菌酶，37°C水浴lOmin。4)依次用含有 10mmol/L EDTAiPO. 3mg/mL PMSF 的 lmol/L NaCl，0. 14mol/L NaCl 和 0. (w/v)SDS 清洗一遍。5)用无菌去离子水清洗一遍。6)80°C水浴热击IOmin后用无菌去离子水清洗三遍。7)取一定量悬液后，将其余悬液装入灭菌后的三角瓶中，4°C避光保存。8)将取出的悬液置于80°C烘箱内烘至恒重，计算出芽孢悬液浓度(mg/ml)，并记 录。本发明枯草芽孢杆菌LS02产生的芽孢漆酶可在pH值2. 2-10.0范围内发挥作用， 催化不同底物的最适PH值有所不同以ABTS为底物时，在pH 3.0时酶活最高；以丁香醛连 氮为底物时，在PH6. 8时酶活最高；以2，6- 二甲氧基苯酚为底物时，在pH7. 8时酶活最高。 本发明枯草芽孢杆菌LS02产生的芽孢漆酶在碱性条件下具有极强的稳定性，在ρΗΙΟ. 0的 条件下30°C保温10天活性不仅没有下降反而有所增加，10天后酶活为初始酶活的3. 8倍 左右。这一特点是绝大多数真菌漆酶所不具备的，由于造纸工业很多采用碱法制浆，使造纸废水碱性较高，该芽孢漆酶在碱性条件下极好的稳定性有利于其在造纸废水等处理中发挥 有效作用。本发明枯草芽孢杆菌LS02产生的芽孢漆酶的酶促反应温度范围较广，其最适温 度为60°C，在50-80°C间可保持较高的活性，80°C时为最高酶活的71 %，即使在90°C的高温 下仍可保持最高酶活的50. 8%，真菌漆酶在此温度下基本完全丧失活性。同时，这种芽孢漆 酶具有较好的热稳定性，在50°C、60°C和70°C下保温IOh后，其酶活分别为初始活性的1. 1、 1. 58和1. 75倍，在80°C保温IOh后残余酶活为初始酶活的86%。这种芽孢漆酶在高温下 极好的稳定性在工业上具有很大的实际应用价值。金属阳离子对所述漆酶的活性有较大的 影响，如 Na+、Li+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+ 和 Co2+ 对其活性有激活作用，而 Ag+、Mn2+、Al3+ 和 Hg2+对酶活有抑制作用，其中Hg2+可使本发明所述的芽孢漆酶完全失活。本发明枯草芽孢 杆菌LS02产生的芽孢漆酶在不同浓度的NaCl下活性变化较大，0. 01mol/L的NaCl对所述 芽孢漆酶的活性有促进作用，0. lmol/L以上浓度的NaCl对活性有抑制作用，在lmol/L的 NaCl存在时可保持原始活性的24. 22%。本发明枯草芽孢杆菌LS02所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有 较好的脱色作用。在介体乙酰丁香酮的参与下，在PH6. 8时对RBBR、活性黑KN-B、靛红和 结晶紫6h后的脱色率分别为85. 2%、87. 84%,96. 18%和92. 57%，靛红和结晶紫几乎完 全脱色。在PH9. 0时对RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫Mi后的脱色率分别为92. 22%, 96. 09%,97. 12%和97. 43%，说明该芽孢漆酶在碱性环境下对各种染料仍保持了较高的脱 色能力。本发明所提供的枯草芽孢杆菌漆酶基因，来自于枯草芽孢杆菌LS02， CGMCCNo. 4261，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列。本发明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定义的核酸分子所编码。本发明进 一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式与SEQ ID No :2的氨基酸序列是相同的或同源的。本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LS02经发酵培养，可制备具 有漆酶活性的芽孢悬液，该制备方法操作简单，成本较低。所制备的芽孢漆酶具有广泛的PH 和温度催化范围，在碱性和高温条件下具有较好的稳定性，比真菌来源的漆酶具有更优越 的适用性。在介体物质乙酰丁香酮的参与下，该芽孢漆酶能对不同化学结构的合成染料有 效脱色，在碱性条件下仍保持了较好的脱色效果，因此本发明提供的芽孢漆酶在工业染料 废水的处理上具有较好的应用前景。
图1是以ABTS为底物时pH对枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶活性的影响；图2是以丁香醛连氮为底物时pH对枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶活性的影响；图3是以2，6- 二甲氧基苯酚为底物时pH对枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶活性的 影响；
图4是枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶在pH10. 0时酶活随时间变化的曲线图；图5是不同温度对枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶活性的影响；图6是枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶在50_80°C时活性的稳定性；图7是不同浓度的NaCl对枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶活性的影响；图8是pH6. 6时枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶以乙酰丁香酮为介体对RBBR、活性黑 KN-B、靛红和结晶紫的脱色结果图9是pH9. 0时枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶以乙酰丁香酮为介体对RBBR、活性黑 KN-B、靛红和结晶紫的脱色结果
具体实施例方式以下的实施方式是为了更好地理解本发明。以下实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可购买到的生化试剂。其中 细菌基因组提取试剂盒和胶回收试剂盒是Omega公司产品，T载体和其他工具酶等均为 TaKaRa公司产品。以下实施方式中所说的酶液，均是按照芽孢漆酶制备方法制备出的枯草芽孢杆菌 LS02芽孢漆酶。酶活测定方法是指用分光光度计检测漆酶与底物反应后吸光度，计算漆酶活性。 所述的底物为丁香醛连氮，2，2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTQ或2，6-二甲
氧基苯酚。酶的活性定义为每分钟氧化1 μ mol底物为产物所需的酶量为一个酶活力单位。 反应体系如下(I)ABTS 反应体系含有lmmol/L ABTS, 100 μ L芽孢悬液，及柠檬酸-磷酸盐缓冲 液(0. lmol/L, pH 3. 0)，总体积3mL, 30°C反应3min后在420nm处测定吸光值。(2) 丁香醛连氮反应体系含有0. lmmol/L 丁香醛连氮，100 μ L芽孢悬液，及柠檬 酸-磷酸盐缓冲液(0. Imo 1/L，pH 7. 0)，总体积3mL, 30°C反应3min后在525nm处测定吸光值。(3)2，6-二甲氧基苯酚应体系含有211111101/1 2，6_ 二甲氧基苯酚，100 μ L芽孢悬 液，及柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0. lmol/L, pH 7. 0)，总体积3mL, 30°C反应5min后在468nm 处测定吸光值。实施例1枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶的性质1. pH值对芽孢漆酶活性和稳定性的影响pH对漆酶活性的影响采用pH2. 2-7. 8柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0. lmol/L)、 ρΗ7· 4-9. OTris-HCl (0. 05mol/L)缓冲液及ρΗ8· 6-10. 0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 (0. 05mol/L)测定，pH对漆酶稳定性的影响通过在30°C时将漆酶与pH3.0、8.0的柠檬 酸-磷酸盐缓冲液，PH9. 0的Tris-HCl缓冲液及pH10. 0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中混 合放置I-IOd后测定剩余活性。图1-3表明，本发明提供的芽孢漆酶催化范围广泛，在 pH2. 2-10. 0的范围内均可催化底物反应，以ABTS，丁香醛连氮和2，6-二甲氧基苯酚为底物 时测得的最适PH分别为3. 0、6. 8和7. 8。图4表明，枯草芽孢杆菌LS02芽孢漆酶在pH10. 0 的环境中具有较好稳定性，IOd后仍可保持较高的活性。
权利要求
1.枯草芽孢杆菌LS02，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.似61。
2.一种芽孢漆酶，该漆酶由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LS02 (Bacillussubtilis)产生的。
3.根据权利要求2所述的芽孢漆酶的制备方法，其特征在于按下列步骤进行a.枯草芽孢杆菌LS02划线接种于固体产孢培养基上，37°C倒置培养5d后，所述的产孢 培养基组份为(g/L)营养肉汤 8 ；KCl 1 ；MgSO4 · 7H20 0. 25 ；MnCl2 · 4H20 0. 002 ；琼脂 17 ； 调pH7. 0后高温高压灭菌，加入过滤除菌的0. 5mmol/LCaCl2及0. 001mmol/L FeSO4 ；b.用无菌去离子水将固体培养基上的芽孢冲洗下来；c.加入终浓度0.lmg/mL的溶菌酶，37°C水浴IOmin ；d.依次用含有10mmol/L EDTA 禾口 0. 3mg/mL PMSF 的 Imol/L NaCl、0. 14mol/L NaCl, 0. 1% (w/v) SDS和无菌去离子水清洗一遍；e.80°C热击IOmin后用无菌去离子水清洗三遍后，装入灭菌后的三角瓶中4°C避光保存。
4.根据权利要求2和3所述的芽孢漆酶，可在pH2. 2-10.0发挥作用，在30°C时催化 底物ABTS的最适pH值为3. 0，催化底物丁香醛连氮的最适pH值为6. 8，催化底物2，6- 二 甲氧基苯酚的最适pH值为7.8。
5.根据权利要求2至4所述的芽孢漆酶，可在20-100°C发挥功能，在pH6. 8以丁香醛 连氮为底物时最适反应温度为60°C。
6.根据权利要求2至5所述的芽孢漆酶，可对不同结构的合成染料包括RBBR(RemaZ0l Brilliant Blue R, CAS No :2580-78-1)，活性黑 KN-B (CAS No 17095-24-8)，结晶紫(CAS No =548-62-9)和靛红(CAS No :860-22-0)进行脱色，脱色条件为:40°C, pH 6. 8 或 9. 0，芽 孢漆酶悬液的终浓度是lmg/ml，染料终浓度分别为RBBR 100mg/L，活性黑KN-B 40mg/L，靛 红25mg/L，结晶紫5mg/L，加入终浓度是0. lmmol/L的漆酶介体乙酰丁香酮。
7.枯草芽孢杆菌具有漆酶活性的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表SEQID No :1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
8.根据权利要求7所述的基因，其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 漆酶基因是序列表中SEQ ID No :1。
9.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)漆酶，是具有序列表中SEQ ID No :2氨基酸残 基序列的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌LS02(CGMCC No.4261)芽孢漆酶的制备方法，催化性质和在染料脱色中的应用。本发明还涉及编码该芽孢漆酶的核苷酸序列。枯草芽孢杆菌LS02在固态产孢培养基上37℃发酵5天后，用去离子水将芽孢冲洗下来，再通过溶菌酶处理等一系列措施获得具有漆酶活性的芽孢悬液。该芽孢漆酶在碱性和高温条件下具有较好的催化活性，在介体作用下对不同结构的合成染料具有较好的脱色效果，可用于工业染料废水的处理。
文档编号C12N15/53GK102115722SQ201010568908
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者卢磊, 李德斌, 李泰仑, 杜美惠, 王天女, 赵丽艳, 赵敏 申请人:东北林业大学