专利名称：一株组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质的表达领域，尤其涉及组成型表达酶的工程菌株的构建，同时本发明也属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过组成型表达的酶来制备L-鸟氨酸及D-精氨酸的方法。
背景技术：
L-鸟氨酸学名为a, S-二氨基戊酸，不参与人体内蛋白质合成，但具备极其重要的生理功能。L-鸟氨酸存在于生物体多种组织和细胞中，在生物体代谢中起到重要作用，是尿素生成的中间产物，参与产尿素的鸟氨酸循环，也是精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，具有解毒作用，对人体肝脏细胞具有重大意义。
D-精氨酸是一种非蛋白质氨基酸，天然原料人工合成，研究表明D-精氨酸具有抗高血压的功效；D-精氨酸的重要生理功能还表现在可抑制癌症扩散，以及治疗生长激素过多释放造成的紊乱等方面。L-鸟氨酸的制备方法包括化学合成法、直接发酵法和水解精氨酸法等几种方法。水解精氨酸法包括碱水解法和酶水解法，其中，酶水解法具有很强的专一性，其反应过程简单，副产物少，反应条件温和，并且避免使用氰化氢等有毒化学品，底物转化率高，生成的L-鸟氨酸纯度高，利于后续分离，因此利用精氨酸作为底物，在精氨酸酶的催化下生成L-鸟氨酸的酶水解方法受到广泛的重视，是目前国内厂家生产L-鸟氨酸的常用方法。Makryaleas等人研究了精氨酸酶水解精氨酸制备L-鸟氨酸的方法，在pH 8. 0
10.0时转化率可高达99%。2005年，焦庆才等对L-精氨酸酶固定化生产L-鸟氨酸进行了研究，L-精氨酸的转化率达到95%，并且采用该种固定化酶法相对于传统酶法水解，在产物与催化剂的分离和工业化生产的连续控制等方面具有明显的优势。张鹏等利用粪肠球菌产生的精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸，产量可高达112g/L，转化率高达99. 5%。目前，D-精氨酸的制备方法主要为酶法制备，即以L-精氨酸为原料，经消旋反应得到DL-精氨酸。李加友和曹瑜等利用粪链球菌的精氨酸脱亚胺酶对L-精氨酸的专一脱亚胺作用来生产D-精氨酸，D-精氨酸的产率为87%，附加产物L-瓜氨酸的产率为88%。现有的生物酶法转化尽管可达到一定高的转化率，但精氨酸酶在制备的过程中大多是需要加入诱导剂，成本较高。
发明内容
本发明的目的是构建一株组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株，使得在精氨酸酶发酵生产中无需加入诱导剂，以缩短发酵周期，降低诱导物、能耗等成本；同时，组成型表达相对于诱导表达更稳定，克服了诱导表达过程中菌株易退化、质粒易丢失的缺陷，为酶法拆分DL-精氨酸生产L-鸟氨酸及D-精氨酸和转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸提供了绿色环保高效的生产方法。本发明提供的组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株，是在本实验室已经构建的能够诱导表达精氨酸酶的重组表达载体pET21a(+) -ARG基础上，通过自杀质粒pRE112，构建重组载体PRE112-ARG，将其转化至不能表达Ji蛋白的宿主细胞E. coli DH5 a，并通过氯霉素(Cm)抗性筛选，获得的组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株E. coli DH5a-ARG。随后对组成型表达的精氨酸酶的酶促反应条件进行了初步研究，为酶法制备L-鸟氨酸和D-精氨酸的生产工艺奠定了基础。 所述的自杀质粒pREl 12与宿主细胞染色体发生重组，使精氨酸酶I基因可组成型表达。所述的自杀质粒PRE112的复制及转化载体的制备和筛选在E. coli S17XpirA宿主细胞进行。本发明提供的构建组成型表达精氨酸酶工程菌的方法，具体包括(I)将精氨酸酶I基因插入到自杀质粒PRE112的多克隆位点，构建重组质粒PRE112-ARG;
(2)将重组质粒转化至宿主菌E. coli S17ApirA，筛选阳性克隆并鉴定；(3)将筛选的阳性菌株培养，提取质粒，并转化至E. coli DH5 a，于Cm/LB平板培养，筛选阳性克隆；(4)菌落PCR鉴定后进行酶活测定，筛选高精氨酸酶活性的菌株，即E.coliDH5 a -ARG。该菌株与实验室保存的诱导型表达的菌株相比，酶活力没有显著性差异。本发明同时涉及组成型表达精氨酸酶的基因工程菌E.coli DH5 a-ARG在L-鸟氨酸和D-精氨酸制备中的应用。所述的应用是以组成型表达精氨酸酶的E.coli DH5 a-ARG菌体作为酶源，以L-精氨酸为底物进行酶促反应，经基因工程菌组成型表达的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制备L-鸟氨酸；或者以底物DL-精氨酸出发，经基因工程菌组成型表达的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制备L-鸟氨酸，同时保留D-精氨酸。酶促反应条件如下，酶源细胞催化条件为f5g/L，转化温度为2(T80°C;转化pH值为6 11 ;Mn2+浓度为0. lmT2mM。最佳的催化反应条件为优选温度为60°C ;优选转化pH值为9. 0 ;优选Mn2+浓度为0. 5mM, 2g/L酶源细胞催化，当底物L-精氨酸浓度为100g/L时，反应12h，底物L-精氨酸的转化率为98. 17%。所述用于组成型表达的精氨酸酶来自以上构建的基因工程菌株E.coliDH5 a-ARG的菌体细胞，由于精氨酸酶I基因已经重组进E.coli DH5 a的基因组中，随着细菌基因组的复制而复制进行表达，该基因成为基因组的一部分，使得精氨酸酶基因的表达无需诱导，表达更稳定。该重组菌株具备表达精氨酸酶的能力，并能进行L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的反应，及以DL-精氨酸为底物拆分制备D-精氨酸和L-鸟氨酸。在本发明实施例中，采用柱前衍生化HPLC法来测定DL-精氨酸及L-鸟氨酸，衍生化试剂为Marfey试剂，即I-氟-2, 4_ 二硝基苯基-5-L-丙氨酸胺(FDAA)。柱前衍生化方法如下以IOOiiL IOmmoI/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解氨基酸，使其终浓度为l(T40mmOl/L，随后加入到1%的FDAA 200ilL丙酮溶液中，4(rC孵育lh后，加入2N HCl 20yL终止反应，20 u L 进样分析。色谱柱C18 色谱柱(Phenomenex Luna 5 u , 100A, 250 X 4. 6mm);进样体积20 ii L。流动相冰(含0. 1%TFA):乙腈(含0. 1%TFA) =45 :55为流动相；室温；流速为 1mT ,/min ;检测波长 340nm。本发明的优点和有益效果
本发明构建了组成型表达精氨酸酶I的基因工程菌株DH5 a -ARG,以L-精氨酸或DL-精氨酸为底物，表达精氨酸酶I的菌体细胞为起始酶源，酶法制备L-鸟氨酸或D-精氨酸。由于采用组成型表达的酶源细胞，在制备的过程中无需加入诱导剂，方便易行，且有效降低成本，并缩短了发酵周期。同时，酶的组成型表达相对于诱导表达更稳定，克服了诱导表达过程中菌株易退化，质粒易丢失的缺陷，因此本发明在L-鸟氨酸和D-精氨酸的绿色工业化生产领域具有良好的产业化前景。
图I是获得的15株组成型表达精氨酸酶活性的Ε. coli DH5 a -ARG的酶活分析；图2是氨基酸的HPLC检测；图3是催化条件的优化，A :反应温度与L-精氨酸转化率的关系；B ρΗ与L-精氨酸转化率的关系；C =Mn2+与L-精氨酸转化率的关系；图4产物L-鸟氨酸HPLC检测结果。
具体实施例方式实施例I精氨酸酶基因的克隆及组成型表达取KM小鼠肝脏，提取mRNA，反转录为cDNA后，根据Genbank提供序列设计引物，PCR扩增ArgI基因，回收后连接至pRE112载体，构建pRE112_ARG载体，常规电转化法转入E. coli S17 ApirA中筛选、鉴定、测序后提取质粒，转化至E. coli DH5 α，于Cm/LB平板培养，筛选并鉴定阳性克隆，最终获得组成型表达精氨酸酶的E. coli DH5 a -ARG。将获得的基因工程菌株于Cm/LB液体培养基中培养过夜，收集菌体细胞，用于L-精氨酸转化，确认是否具备精氨酸酶活性。催化体系为底物L-精氨酸用量为5g/L ；Mn2+浓度为ImM ;转化pH值为8 ;转化时间为lh，转化温度为37°C。酶活力定义在上述条件下，Ih内转化I μ mol精氨酸的酶量为一个酶活力单位。筛选获得的15个菌株中，分别测定其酶活力，如图I所示，最高可达873U/g。实施例2反应液中L-鸟氨酸及DL-精氨酸的高效液相色谱法检测以IOOyL IOmmoI/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解DL-精氨酸及L-鸟氨酸，使其终浓度为l(T40mmOl/L，随后加入到1%的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育Ih后，加入2N HCl 20 μ L终止反应，20 μ L进样分析。色谱柱C18色谱柱(Phenomenex Luna5μ，100Α, 250X4. 6mm);进样体积20μ L0流动相水乙腈(含O. 1%TFA)=1 1为流动相；室温；流速为lmL/min ;检测波长340nm，检测结果如图2所示，L-鸟氨酸、D-精氨酸、L-精氨酸和FDAA均可有效分离。实施例3组成型表达的精氨酸酶反应条件优化以上述实施例I组成型表达精氨酸酶的E. coli DH5 a -ARG的菌悬液为酶源(2g/L)，反应体系中Mn2+浓度为O. lmT2mM ;转化温度为2(T80°C ;转化pH值为6 11 ;考察不同的转化条件对L-精氨酸转化率的影响。在最适反应条件下，测定底物L-精氨酸的浓度由10g/L到100g/L，反应达到90%以上的时间。并采用实施例2中的方法检测L-鸟氨酸的含量，计算L-精氨酸的转化率。图3A :考察反应温度与L-精氨酸转化率的关系；底物L-精氨酸用量为20g/L ；Mn2+为ImM ;转化pH值为8 ;转化时间为3h。图3B :考察pH与L-精氨酸转化率的关系；底物L-精氨酸用量为20g/L ；Mn2+为ImM ;转化时间为3h ;转化温度为60°C。图3C :考察Mn2+与L-精氨酸转化率的关系；底物L-精氨酸用量为10g/L ;转化温度为60°C ;转化pH值为9. O ;转化时间为3h。确认最佳转化条件反应温度，60°C ；pH 9 ；Mn2+浓度，O. 5mM。 在最适酶促反应条件下，当底物L-精氨酸浓度为100g/L时，反应12h底物L-精氨酸的转化率为98. 17%。实施例4L-鸟氨酸的制备及分离以实施例3确定的最佳条件，以组成型表达的酶源细胞为酶源酶法制备L-鸟氨酸，随后过滤，收集上清液，采用重结晶方法制备L-鸟氨酸，IOOmL体系中加入0. 2g酶源细胞，IOg L-精氨酸，可制备L-鸟氨酸白色粉末7. 48g，采用HPLC检测，产物纯度达到98. 9%(图 4)。实施例5DL-精氨酸的拆分以实施例3确定的最佳条件，以组成型表达的酶源细胞为酶源酶法拆分DL-精氨酸，随后过滤，收集上清液，采用大孔吸附树脂001 X 7层析分离，制备L-鸟氨酸和D-精氨酸，IOOmL体系中加入0. 2g酶源细胞，20g DL-精氨酸，可制备L-鸟氨酸白色粉末7. 44g，D-精氨酸9. 71g，采用HPLC检测，产物纯度均达到98. 1%以上。
权利要求
1.一株组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株，其特征在于该菌株是在能够诱导表达精氨酸酶的重组表达载体pET21a(+)-ARG基础上，通过自杀质粒pRE112，构建重组载体PRE112-ARG，将其转化至不能表达Ji蛋白的宿主细胞E. coli DH5 a，并通过氯霉素(Cm)抗性筛选，获得的组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株E. coli DH5 a -ARG。
2.根据权利要求I所述的工程菌株，其特征在于所述的自杀质粒PRE112与宿主细胞染色体发生重组，使精氨酸酶I基因可组成型表达。
3.根据权利要求I所述的工程菌株，其特征在于所述的自杀质粒PRE112的复制及转化载体的制备和筛选在E. coli S17 A pirA宿主细胞进行。
4.权利要求I所述的基因工程菌株E.coli DH5 a -ARG在L-鸟氨酸和D-精氨酸制备中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于以组成型表达精氨酸酶的E.coliDH5 a -ARG菌体作为酶源，以L-精氨酸为底物进行酶促反应，酶源细胞催化条件为f 5g/L，转化温度为2(T80°C ;转化pH值为6 11 ;Mn2+浓度为0. lmlT2mM。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于在优选温度为60°C;优选转化pH值为.9.0 ;优选Mn2+浓度为0. 5mM的最适反应条件下，2g/L酶源细胞催化，当底物L-精氨酸浓度为100g/L时，反应12h，底物L-精氨酸的转化率为98. 17%。
全文摘要
一株组成型表达精氨酸酶的基因工程菌株及其应用。通过自杀质粒pRE112构建组成型表达精氨酸酶的基因工程菌菌株E.coliDH5α-ARG，其筛选后获得的高活性菌株酶活力为873U/g，该菌株与实验室保存的诱导型表达的菌株相比，酶活力没有显著性差异。优化的最佳催化反应条件为反应温度，60℃；pH9.0；Mn2+浓度，0.5mM。最适反应条件下，以2g/L细胞为酶源，当底物L-精氨酸浓度为100g/L时，反应12h，底物L-精氨酸的转化率为98.17%。利用该酶源在该条件下转化10gL-精氨酸可制备L-鸟氨酸7.48g，纯度为98.9%，拆分20gDL-精氨酸可制备L-鸟氨酸7.44g和D-精氨酸9.71g，二者纯度均达98.1%以上。
文档编号C12N15/70GK102703370SQ201210177959
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者张奇, 李鸣, 杨洁, 白芳, 白钢 申请人:南开大学