一种环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新型环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用，所述新型环糊精糖基转移酶为SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位上突变的突变体。该新型环糊精糖基转移酶热稳定性和贮存稳定性好，活性高，将该酶应用于生产AA-2G，提高产率，提高维生素C转化率，该环糊精糖基转移酶适合AA-2G的大规模生产。应用本发明的新型CGT酶，AA-2G产量可达170g/L，维生素C的转化率可达55％-60％。
【专利说明】一种环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程与酶工程领域，涉及一种用于以β-环糊精、维生素C为底物合成AA-2G的环糊精糖基转移酶及其变体，具体为衍生自Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 的 CGT 酶(cyclomaltodextringlucanotransferase)的环糊精糖基转移酶及其变体。
【背景技术】
[0002]维生素C是一种人体不能自身合成的水溶性维生素，在体内发挥重要的生理作用。然而，由于还原性强所导致的极不稳定性，使得其应用受到很大限制，因此，上世纪以来，开发既能保证维生素C的正常生理功能又具有较好稳定性的维生素C衍生物称为研究执占。
[0003]2-氧-a-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)为维生素C的糖类衍生物，因具有以下优点成为维生素C的最佳替代品:1)良好的非还原活性，在水溶液中稳定；2)良好的耐热性和耐光性；3)在胞内水解生产维生素C和葡萄糖，具有与维生素C同等的生物活性。 [0004]目前，在糖基转移酶催化下将供体上的葡萄糖苷转移到维生素C的2位C上是合成AA-2G的唯一途径。已经开发的用于合成AA-2G的酶有5种，其中环糊精糖基转移酶(CGT酶)因其底物特异性特别强称为合成AA-2G中使用最广泛的酶源。
[0005]环糊精糖基转移酶(CGT酶)是一个多功能型酶，能够催化包括环化反应、歧化反应、偶合反应以及水解反应在内的多种反应。通过偶合和歧化反应，CGT酶能够催化供体如淀粉或环糊精上的低聚糖转移至受体分子例如维生素C，显著提高受体分子的功能性、水溶性和稳定性。
[0006]现有技术中使用CGT酶生产AA-2G的主要问题在于:I)酶的热稳定性和贮存稳定性较差，不适合AA-2G的生产；2)转化率不高，较低的产量限制了 AA-2G的大规模生产。
【发明内容】
[0007]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用，使环糊精糖基转移酶热稳定性和贮存稳定性更好，活性高，将该酶应用于生产AA-2G，提高产率，提高维生素C转化率，使该环糊精糖基转移酶适合AA-2G的大规模生产。
[0008]本发明的技术解决方案如下:
[0009]一种环糊精糖基转移酶，所述环糊精糖基转移酶为SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位有1_5个的氨基酸残基置换的突变体。
[0010]所述突变为将55位的甘氨酸置换为丙氨酸、77位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、121位的甘氨酸置换为缬氨酸、331位的亮氨酸置换为异亮氨酸、543位的苏氨酸置换为酪氨酸、604位的天冬酰胺置换为甘氨酸以及615位的苯丙氨酸置换为丙氨酸。
[0011]SEQ ID NO:2 所不氨基酸序列为 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株的CGT酶的氨基酸序列。[0012]根据本发明所述的环糊精糖基转移酶，优选的是，所述环糊精糖基转移酶为SEQID N0:4、6、8、10、12、14、16、18 所示的氨基酸序列。
[0013]根据本发明所述的环糊精糖基转移酶，进一步优选的是，所述环糊精糖基转移酶为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0014]本发明还提供一种编码所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、17 所示。
[0015]本发明还提供一种编码所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3 所示。
[0016]本发明还提供一种制备所述环糊精糖基转移酶的方法，包括如下步骤:提取和扩增编码野生型CGT酶的DNA序列，利用易错PCR、定向进化技术建立突变文库，经筛选，获得所述新型环糊精糖基转移酶。
[0017]本发明还提供一种所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用。
[0018]根据本发明所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用，所述在制备2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用为将β -环糊精与抗坏血酸溶于水中，调节PH为5-7，加入所述新型环糊精糖基转移酶，在温度30_60°C反应，终止反应，经分离纯化得到2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸。
[0019]所述在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用中将β _环糊精与抗坏血酸溶于水中，优选调节 pH为5.5-6.0。
[0020]所述在制备2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用中，优选反应温度37-55。。。
[0021]发明详述:
[0022]本发明提供了一种新的闻活性和闻稳定性的环糊精糖基转移酶(CGT酶)。所述 CGT 酶衍生自 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 的 CGT 酶(eyelomaltodextringlucan otransferase),具有如 SEQ ID 顯:4、6、8、10、12、14、16、18,优选SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0023]在本发明的另一方面，提供用于编码上述CGT酶的DNA分子，所述DNA分子具有如SEQ IDN0:3、5、7、9、11、13、15、17，优选 SEQ ID NO:3 所示的核苷酸序列。
[0024]本发明提供上述CGT酶的若干变体。所述变体具有1-5个位点的氨基酸残基置换，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、18所示。此外，还提供了用于编码这些变体的 DNA 序列，如 SEQ IDN0:3、5、7、9、11、13、15、17 所示。
[0025]为了获得上述CGT酶及其变体，本发明技术方案为:
[0026]从编码野生型CGT酶的核苷酸序列出发，利用定向进化技术建立突变文库，然后进行高通量筛选，从而最终获得酶活性和/或稳定性显著增加的突变体。
[0027]所述野生型CGT 酶来自 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株。
[0028]编码野生型CGT酶的DNA片段通过设计引物从Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l菌株的基因组PCR扩增获得。
[0029]所述定向进化技术包括但不限于随机突变。获得的含有突变的DNA片段通过酶切连接到PET载体上，然后转化入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株进行表达。[0030]所述高通量筛选中，酶活性的测定使用甲基橙法:诱导表达后离心收集菌体，然后加入适量反应混合液(2%的可溶性淀粉，50mM KH2P04-Na2HP04缓冲液，pH6.0)，50°C反应IOmin后，加入盐酸溶液终止反应，离心，取上清加入甲基橙显色，使用分光光度计在505nm处测定吸光值。定义该条件下每分钟生成I μ mol α -环糊精所需的酶量为一个酶活单位⑶。
[0031]突变体的编码DNA序列通过测序获得。
[0032]通过上述方法，获得了一种新型CGT酶，其活性高达野生型CGT酶的2_3倍。还获得了该新型CGT酶的若干变体，变体的活性相比野生型CGT酶也有所增加。
[0033]与野生型CGT酶序列相比，本发明新型CGT酶及其变体的序列包含以下一个或多个突变位点:55位丙氨酸替代甘氨酸、77位亮氨酸替代苯丙氨酸、121位缬氨酸替代甘氨酸、331位异亮氨酸替代亮氨酸、543位酪氨酸替代苏氨酸、604位甘氨酸替代天冬酰胺以及615位丙氨酸替代苯丙氨酸突变。
[0034]本发明还提供一种所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用。
[0035]根据本发明所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用，所述在制备2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用为将β -环糊精与抗坏血酸溶于水中，调节PH为5-7，加入所述新型环糊精糖基转移酶，在温度30_60°C反应，终止反应，经分离纯化得到2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸。 [0036]本发明提供上述CGT酶及其变体用于以β -环糊精、维生素C为底物合成AA-2G的用途。其中，反应条件为:ρΗ5-7，温度30-60°C。
[0037]SEQ ID NO:1 为编码来源于 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株的野生型 CGT 酶的核苷酸序列。SEQ ID NO:2 为来源于 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l菌株的野生型CGT酶的氨基酸序列。
[0038]SEQ ID NO:3为编码本发明新型CGT酶的核苷酸序列。SEQ ID NO:4为本发明新型CGT酶的氨基酸序列。SEQ ID NO:5为发明新型CGT酶编码变体I的核苷酸序列。SEQ IDNO:6为本发明新型CGT酶变体I的氨基酸序列。SEQ ID NO:7为发明新型CGT酶编码变体2的核苷酸序列。SEQ ID NO:8为本发明新型CGT酶变体2的氨基酸序列。SEQ ID NO:9为发明新型CGT酶编码变体3的核苷酸序列。SEQ ID NO: 10为本发明新型CGT酶变体3的氨基酸序列。SEQ IDN0:11为发明新型CGT酶编码变体4的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12为本发明新型CGT酶变体4的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13为发明新型CGT酶编码变体5的核苷酸序列。SEQ ID NO: 14为本发明新型CGT酶变体5的氨基酸序列。SEQ ID NO: 15为发明新型CGT酶编码变体6的核苷酸序列。SEQ ID NO: 16为本发明新型CGT酶变体6的氨基酸序列。SEQ ID NO: 17为发明新型CGT酶编码变体7的核苷酸序列。SEQ ID NO: 18为本发明新型CGT酶变体7的氨基酸序列。
[0039]本发明中概念术语解释:
[0040]术语“变体”多肽或多核苷酸在本文中是指由于在亲本序列中的一个或多个氨基酸残基的插入、缺失和/或置换而与“亲本”多肽或多核苷酸序列在氨基酸或核苷酸序列上不同的分子。变体多肽或多核苷酸具有与亲本多肽或多核苷酸类似或相同的功能。变体多肽具有与亲本多肽类似的氨基酸序列，并符合以下中的至少一种:具有同一性为至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%和至少约98 %中的一种或多种和/或被保守取代的氨基酸序列的多肽。变体多核苷酸具有与亲本多核苷酸类似的氨基酸序列，并符合以下中的至少一种:(i)变体核苷酸序列编码的多肽与亲本多肽具有至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%和至少约98%中的一种或多种的同一性；或(ii)变体多核苷酸序列在如本文中定义的严格条件下与亲本多核苷酸序列杂交。
[0041]本发明中Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株:木聚糖降解嗜热菌，嗜热菌，极端微生物的一种。在工业生物【技术领域】嗜热菌是很好的基因来源菌种。本发明中 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株 CGT 基因序列来源于 NCBI 数据库公开(Sequence ID:ref | YP_004470341.11)，经由中美泰和公司全基因合成而来。
[0042]本发明中菌株大肠杆菌BL21(DE3)购买自全式金公司。
[0043]本发明中的LB液体培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4。
[0044]本发明采用的易错PCR技术:易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。
[0045]本发明采用的发酵培养基为M9培养基(Na2HPO4 6g/L ；KH2PO4 3g/L ； (NH4) 2S04
2.24g/L ；NaCl 0.5g/L ；MgS04.7H20 0.246g/L ;葡萄糖 2g/L ;)，补料为 60%葡萄糖，氨水调节pH。发酵培养控温37°C，pH6.5 ;培养8h时溶氧突变，0D20,开始补料。0D30诱导，IPTG终浓度ImM，诱导温度控至25°C，pH7.0。培养2Ih时放罐。
[0046]本发明采用的筛选:易错PCR产物通过基因工程构建方式最终转化入BL21 (DE3)菌株中。平板生长单克隆。通过挑取不同单克隆诱导表达的方式确定正向突变菌株，将酶活提升的菌株送测序确定突变位点。
[0047]应用本发明的新型CGT酶，AA-2G产量可达170g/L，维生素C的转化率可达55% -60%。转化率的计算方式为:用实际生成的AA-2G的质量比上初始反应投入的Vc质量对应的理论AA-2G产量。
[0048]本发明的有益技术效果:
[0049]本发明提供的一种新型环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用，该新型环糊精糖基转移酶热稳定性和贮存稳定性好，活性高，将该酶应用于生产AA-2G，提高产率，提高维生素C转化率，该环糊精糖基转移酶适合AA-2G的大规模生产。利用本发明的新型CGT酶，AA-2G产量可达170g/L，维生素C的转化率可达55% -60%。
【具体实施方式】
[0050]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0051] 本实施例涉及的实验仪器、材料和试剂:如下表
[0052]表1
【权利要求】
1.一种环糊精糖基转移酶，其特征是:所述环糊精糖基转移酶为SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位有1_5个的氨基酸残基置换的突变体。
2.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征是:所述环糊精糖基转移酶为SEQID N0:4、6、8、10、12、14、16、18 所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征是:所述环糊精糖基转移酶为SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求2所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ IDΝΟ:3、5、7、9、11、13、15、17 所示。
5.一种编码权利要求3所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ IDNO:3所示。
6.一种制备权利要求1-3所述环糊精糖基转移酶的方法，包括如下步骤:提取和扩增编码野生型CGT酶的DNA序列，利用易错PCR、定向进化技术建立突变文库，经筛选，获得所述新型环糊精糖基转移酶。
7.—种权利要求1-3所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用。
8.根据权利要求7所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用，其特征是:所述在制备2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用为将β -环糊精与抗坏血酸溶于水中，调节PH为5-7，加入所述新型环糊精糖基转移酶，在温度30_60°C反应，终止反应，经分离纯化得到2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸。
【文档编号】C12N15/54GK104017784SQ201410236224
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】邢将军 申请人:江苏诚信制药有限公司