一种特异性基因片段及其编码多肽与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种特异性基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该特异性基因片段互补链如SEQIDNO.3所示，所述多肽可以用于检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇；本发明所提供的多肽可与DON特异结合，作为DON抗体的候选多肽，抗体的制备可以不经免疫过程，既可以省去制备单克隆抗体的细胞融合，又避免了动物免疫的局限性，该多肽可大量制备，提高多肽在包被孔中的有效浓度，简化DON毒素检测流程，提高检测效率。
【专利说明】一种特异性基因片段及其编码多肽与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，特别是一种特异性基因片段及其编码多肽与应用。
【背景技术】
[0002]脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是由禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum, Schw)侵染禾谷类作物,经代谢产生的一种单端孢霉烯族毒素,是引起小麦赤霉病的重要因素。DON主要污染小麦、大麦、玉米等谷物及其制品，其具有致动物呕吐等急性毒素性、生殖毒性、免疫毒性，是我国恶性肿瘤高发区居民粮食优势污染霉菌毒素之一，因此，及时对食品及其原料中的DON进行检测，防止被DON污染的食品进入食物链，是保障人民粮食安全的重要手段。
[0003]目前，DON的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱法，但这些方法在检测过程中需要使用大量的有机溶剂、设备，并且DON样品必须经过繁杂的净化过程，费时费力，且检测费用昂贵，不适用于数量较多样品的检测。免疫学检测法是目前最为常用的DON检测方法，其在制备DON免疫抗体的基础上，利用间接酶联免疫检测法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)来测样品中DON的含量,该方法具有高选择性、灵敏、快速、对样品的纯度要求不高等优点。但目前常用制备DON抗体的方法为免疫血清抗体和单克隆抗体，免疫血清学抗体为多克隆抗体，免疫球蛋白类别不均一，抗体的特异性与亲合力在不同批次之间差异较大，而单克隆抗体由于动物免疫的局限性，制备高效价的DON单克隆抗体比较困难。
[0004]噬菌体表面展示技术是一种新型基因表达筛选技术，其将外源蛋白分子或多肽与曬菌体外膜蛋白融合表达，展不在曬菌体表面，曬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低等突出优点，因此利用该技术可直接从庞大的噬菌体表面展示库中筛选到能与目标抗原特异结合的多肽，抗体的制备可以不经过免疫过程，既省去了制备单克隆抗体的细胞融合，又避免了动物免疫的局限性，并且噬菌体可多次扩增，大量制备多肽和蛋白质，适合大规模生产各种免疫诊断试剂盒，在蛋白分子相互识别、新型疫苗研制及药物开发等领域具有广泛应用前景。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明利用噬菌体表面展示技术，提供一种用于检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的基因及其编码多肽，迅速、准确地检测样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，本发明是这样实现的:
一种用于检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的特异性基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]本发明所述序列为SEQ ID N0.2特异性基因片段的互补链，其核苷酸序列如SEQID N0.3 所示。
[0007]本发明所述序列为SEQ ID N0.2特异性基因片段编码的多肽，其氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0008]本发明所述多肽在检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
[0009]本发明提供的与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异结合的多肽的氨基酸序列为SEQ IDN0.1，大小为7aa;编码上述与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异结合的多肽的核苷酸序列为SEQ IDN0.2，大小为21bp ;上述与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异结合的多肽的核苷酸序列的互补链核苷酸序列为SEQ ID N0.3，大小为21bp。
[0010]本发明利用噬菌体表面展示技术筛选到能与DON人工抗原特异结合的多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链，与现有的DON抗体合成方法相比，本发明的有益效果在:
(O本发明所提供的多肽可与DON特异结合，作为DON抗体的候选多肽，抗体的制备可以不经免疫过程，既可以省去制备单克隆抗体的细胞融合，又避免了动物免疫的局限性；
(2)含有该多肽的噬菌体可多次扩增，大量制备该多肽，用于大规模生产免疫诊断试剂盒;
(3)该多肽可大量制备，提高多肽在包被孔中的有效浓度，简化DON毒素检测流程，提高检测效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为实施例多肽与DON人工抗原的酶联免疫吸附检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0012]实施例中涉及的试剂:
1、纯化的DON人工抗原DON-HG-BSA(简称DON人工抗原):本实验室采用丁基硼酸封闭法人工合成；
2、3%BSA封阻缓冲液:即为3% (W/V)的牛血清蛋白溶液，作用为封阻抗原与其他非特异性物质结合；
3、曬菌体随机7肽:购自美国NewEngland B1labs公司；
4、宿主菌ER2738:购自美国New England B1labs公司；
5、PEG/NaCl:购自南京生兴生物技术有限公司；
6、兔抗M13卩遼菌体抗体,购自美国AffinityB1reagents公司
7、HRP标记的羊抗兔抗体，购自北京博奥森公司；
8、1%明胶封闭液，购自南京生兴生物技术有限公司；
9、竞争性洗脱液:将5(^g/mLDON溶于I mL PBS溶液获得；
10、PBS与吐温-20的混合液:将PBS与吐温-20混合，混合液中吐温-20的体积分数为5% ο
[0013]实施例所涉及的序列:
SEQ ID N0.1: Met Ala Pro Gly Trp Val Pro
SEQ ID N0.2:ATGGCGCCGG GTTGGGTTCC G
SEQ ID N0.3:CGGAACCCAA CCCGGCGCCA T
实施例1筛选多肽
(I)将10 μ g纯化的DON人工抗原DON-HG-BSA (简称DON人工抗原)溶于50-100 μ LPBS后包被于微孔板，4 °C过夜，次日加入100-150 μ L3% BSA封阻缓冲液，4°C封闭2 h，再用含0.1 % (W/V)吐温-20的TBS洗涤后，加入1.50X1011 PFU噬菌体随机7肽，室温180-300rpm振摇I h，以TBS洗涤后，加入竞争性洗脱液100 μ L，振摇10 min,回收洗脱产物；
向洗脱产物中加入生长至对数生长前期，OD600=0.5-0.8的宿主菌ER2738培养液中，370C 180-300rpm 振摇 4.5 h,然后 4°C 1000rpm 离心 10 min,取上清液加入 PEG/NaCl 沉淀噬菌体，PEG/NaCl加入量为上清液体积的1/6，测定扩增噬菌体的滴度，重复上述离心步骤，进行4轮筛选后，即获得高亲和力噬菌体。
[0014](2)将25 μ g/mL DON人工抗原和25 μ g/mL BSA分别包被微孔板，37°C孵育6 h，用PBS和吐温-20的混合液洗板3次，再用1% (W/V)明胶封闭液4°C封阻过夜，次日用PBS和吐温-20的混合液洗板3次；再每孔加入1.0X 111 PFU步骤I获得的高亲和力噬菌体，37°C孵育I h，再用PBS和吐温-20的混合液洗板6次；每孔加入100 μ L用PBS按1:10000比例稀释的兔抗Μ13噬菌体抗体，370C孵育I h，用PBS和吐温-20的混合液洗板4次；每孔加100 μ L用PBS按1:3000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，37°C孵育I h ；
(3)洗涤、显色、终止按常规方法进行，本实施例是依照《精编分子生物学实验指南》(F.奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社，1998)所述方法进行，酶标仪读取0D492值。
[0015](4)将DON人工抗原包被孔中的OD值与BSA包被孔中的OD值比值大于3的噬菌体作为筛选噬菌体，进行单克隆扩增测序，得到与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)特异结合的多肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，其互补链序列如SEQ ID N0.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
[0016]实施例2
将DON人工抗原分别用PBS稀释成6个梯度:50 μ g/mL、25 μ g/mL、12.5 μ g/mL、
6.25 μ g/mL、3.13 μ g/mL和1.56 μ g/mL，分别将其包被于微孔板，37 °C孵育6 h，采用PBS和吐温-20的混合液洗板3次，1%明胶封闭液4°C封阻过夜，再用PBS和吐温-20的混合液洗板3次，每孔加入1.0X 111 PFU实施例1获得的筛选噬菌体，37°C孵育I h，用PBS与吐温-20的混合液洗板6次；每孔加入100 μ L用PBS按1:10 000比例稀释的兔抗Μ13噬菌体抗体，37°C孵育I h，用PBS和吐温-20的混合液洗板4次；每孔加100 μ L 1:3 000稀释HRP标记的羊抗兔抗体，37°C孵育I h ；
此后洗涤、显色、终止按与实施例1相同方法进行，酶标仪读取0D492值，以抗原浓度的对数值为横坐标，光吸收值为纵坐标建立相关性曲线(见图1)，由图1可见，非特异结合肽段的光吸收值与包被抗原浓度的变化没有相关性，而含该特异肽段的噬菌体光吸收值与抗原包被浓度对数值呈线性相关，经计算其相关性为0.993，已达到极显著水平，证明该肽段能与DON人工抗原特异结合。
【权利要求】
1.一种特异性基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如权利要求1所述特异性基因片段的互补链，其核苷酸序列如SEQID N0.3所示。
3.—种如权利要求1所述特异性基因片段编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.如权利要求3所述多肽在检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
【文档编号】C12N15/13GK104450730SQ201410656624
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】张旭, 邢锦城, 马鸿翔, 张瑜, 余桂红 申请人:江苏省农业科学院