专利名称：N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物的n-氧化物的制作方法
N-苯基-2-嘧咬-胺衍生物的N-氧化物
本申请是申请日为2003年1月22日、申请号为03802708.9、发明名
称为"N-苯基-2-嘧咬-胺衍生物和N-氧化物"的中国专利申请的分案申请。 本发明涉及其中至少 一个氮原子带有氧原子以形成相应N-氧化物的 N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物、其制备方法、包含这些化合物的药物组合物以 及其在制备用于治疗性治疗包括人在内的温血动物的药物组合物中的用 途。
本发明特别涉及式I化合物
R为氢或羟基，
R:为氢、低级烷基或羟基-低级烷基， A为-NRsR6、 -CR5R^-OR5R6，
RsR6—起代表含有四个、五个或六个碳原子的亚烷基、含有一个氧原 子和三个或四个碳原子的氧杂-低级亚烷基，或含有一个或两个氮原子和两 个、三个或四个碳原子的氮杂-低级亚烷基，其中氮原子是未取代的或被低 级烷基、幾基-低级烷基或乙酰基取代，且其中每种情况下的低级亚烷基可 以是部分或完全不饱和的和/或当低级亚烷基不是完全不饱和时，低级亚烷 基的碳原子可被低级烷基、羟基、低级烷氧基或氧代基取代，且
其中至少一个氮原子带有氧原子以形成相应的N-氧化物，或当没有氮
其中:原子带有氧原子时，A在环碳上被氧代基取代， 或所述化合物的可药用盐。
优选A在环碳上被氧代基取代。
优选A为吡咯烷子基(pyrrolidino)、哌咬基、艰咬子基(pepridino)、 哌"秦基、吡啶基、吡咯烷子基、吡咯烷基、吗啉代、低级烷基哌嗪子基 (piperazino)、 N-甲基哌溱子基、4-曱基-3-氧代-l-哌溱基、3-氧代-l-哌溱基、 1H-咪唑基、1H-2-甲基咪唑基、1H-4-甲基咪唑基或1H-2，4-二甲基咪唑基、 环己基或苯基，任选地在环碳上被氧取代；
最优选"A"代表下式A，的哌溱子基
—N N —K
其中R3代表氢、低级烷基或乙酰基。
优选这样的式I化合物，其中 &为氢，
Rz为氢、甲基或羟甲基，
A为A，，任选地在环碳上被氧取代，
R3为甲基或氢，
或所述化合物的盐。
当"A"在环碳上被氧取代时，"A，，优选选自低级烷基-氧代-哌嗪子 基如4-甲基-3-氧代-l-哌溱基或氧代-哌溱子基如3-氧代-l-P底嗪基、氧代-吡p各烷子基、氧代-哌啶子基、氧代-哌咬基、氧代-吗啉代、氧代-环己基、 琥珀酰亚胺基或戊二酰亚胺基。
带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子优选位于嘧啶、氮茚基 (pyrindinyl)、 "A"或式A，的p底噢子基上的环氮原子。
对于定义"RsR6—起"，申请人在列举中未将NR5R6、 CRsR6或OR5R^ 中提及的氮、氧或碳基团包括在内。
前缀"低级，，表示含有不超过且包括最多7个、特别是不超过且包括最多4个碳原子的基团，所述基团为直链或具有单个或多个分支的支链。
低级烷基优选为含有1个且包括1个至不超过7个且包括7个、优选 1个且包括1个至4个且包括4个碳原子的、直链或支链的烷基；优选地， 低级烷基为丁基如正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、丙基如正丙基或异 丙基、乙基或甲基。低级烷基优选为甲基、丙基或叔丁基。 羟基-低级烷基优选为羟甲基、2-羟乙基或2-羟基-2-丙基。 低级烷氧基特别地为曱氧基、乙氧基、异丙氧基或叔丁氧基。 在一个优选的方面，本发明涉及式II化合物
其中
Ri为氢或羟基，
R2为低级烷基或羟基-低级烷基， R3为氢、甲基或乙酰基，且
星号指示任选带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子，
条件是如果&为氢、R2为曱基且R3为氢或甲基，则用星号标记的
三个氮原子中的至少一个带有氧原子，
或所述化合物的盐。
任选地，2-嘧啶的氮原子也可以带有一个或两个氧原子以形成相应的
N-氧化物。
优选地，式II化合物带有至少一个氧原子以形成相应的N-氧化物。 任选地，哌溱基被氧代基取代，以形成低级烷基-氧代-哌溱子基如4-
、甲基-3-氧代-l-P底溱基或氧代-哌溱子基如3-氧代-l-哌溱基。
在式II化合物范围内，术语"低级，，表示含有不超过7个且包括7个、
优选不超过4个且包括4个碳原子的基团。
当&为羟基时，3-吡^部分在2、 4、 5或6位的环碳原子上被羟基取代。
低级烷基R2优选为甲基。
羟基-低级烷基R2优选为羟甲基。 盐特别地为式I或II化合物的可药用盐。
所述盐由含碱性氮原子的式I或II化合物形成，例如以酸加成盐的形 式，优选与有机酸或无机酸加成的盐，特别是可药用的盐。
为了分离或纯化目的，也可能使用不可药用的盐，例如苦"未酸盐或高 氯酸盐。只有可药用盐或游离化合物(如果需要，以药物组合物形式)可实 现治疗用途，因此优选这些化合物。
鉴于游离形式的新化合物和其盐形式之间的密切关系，上下文中任何
对游离化合物的提及应理解为也提;M目应的盐为宜，所述的盐包括那些例 如在新化合物的纯化或鉴别中可用作中间体的盐。
式i或ii的化合物具有有价值的药理学性质，可例如用作抗肺瘤剂、 用作治疗动脉粥样硬化的活性剂、用作治疗再狭窄的活性剂、用作抗白血
病剂以预防移植i秀发的疾病如闭塞性细支气管炎，和/或用于预防某些细菌 如牙龈卟啉单胞菌(7>017;/^^11^" ^/|^/做/的4曼入温血动物细胞。
蛋白的磷酸化长期以来公知为细胞分化和分裂的必须步骤。磷酸化为 蛋白激酶催化，蛋白激酶细分为丝氨^/苏氨酸和酪氨酸激酶。酪氨酸激酶 包括PDGF(血小板衍生的生长因子)受体酪氨酸激酶。
PDGF是非常常见的生长因子，其在正常生长和病理性细胞增殖中发 挥重要作用，如在癌发生中和血管平滑肌细胞疾病例如动脉粥样硬化和血 栓形成中所见。
如E. Andrejauskas國Buchdunger和U. Regenass在Cancer Research 5353-5358(1992)中所述，在A431细胞的PDGF受体免疫复合物中测体酪氨酸激酶活性的体外抑制。式I或II化合物抑 制PDGF-依赖性非细胞受体磷酸化。对PDGF受体酪氨酸激酶的抑制用 微量滴定ELISA测定法进行测定(参见Trinks等人，J. Med. Chem. ^2, 1015-27(1994)。
对PDGF受体酪氨酸激酶的抑制使得式I或II化合物还适用于治疗肿 瘤疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤以及结肠、乳腺和卵巢肿瘤。
式I或II化合物还可抑制涉及所谓的干细胞因子(SCF，也称为c-Kit 配体或青灰因子)的细胞过程，如SCF受体(Kit)自体磷酸化和SCF-刺激的 MAPK激酶(促分裂原活化的蛋白激酶)的活化。
具体而言，式I或II的化合物抑制c-Kit的酪氨酸激酶活性。这可以 在用c-Kit胞浆激酶域进行的酪氨酸激酶抑制试验中显示。所述试验如下 进行用杆状病毒供体载体pFbacGOl(GIBCO)产生表达人c-Kit胞浆激酶 域的氨基酸区域氨基酸544-976的重组杆状病毒。c-Kit胞浆域的编码序列 被来自人子宫c-DNA库的PCR(Clontech)扩增。用BamHl和EcoRI消化 以4吏扩增的DNA片断和pFbacGOl载体适于连接。这些DNA片断的连接 产生了杆状病毒,质粒c-Kit。病毒的产生、Sf9细胞中的蛋白表达以及 GST-融合蛋白的纯化如下进行
病毒产生将含c-Kit激酶域的转移载体(pFbacGOl-c-Kit)转染至 DH10Bac细胞系(GIBCO),并将转染的细胞涂布至选择性琼脂板上。病毒 基因组(被细菌携带)中未插入融合序列的菌落为蓝色。将单一白色的菌落 取出，并用标准质粒纯化方法从细菌中分离病毒DNA(杆粒)。然后在25cm2 的烧瓶中用Cellfectin试剂以病毒DNA转染Sf9细胞或Sf21细胞(美国典 型培养物保藏中心)。
Sf9细胞中小规模蛋白表达的测定由转染的细胞培养物中收集含病 毒的培养基，并用于感染以增加其滴度。将两轮感染后获得的含病毒的培 养基用于大M的蛋白表达。对于大,的蛋白表达，将100cm2圆形组织 培养板接种，5xl(T个细胞/板，并用lml含病毒的培养基(约5MOI)感染。 3天后，将细胞从板上刮离并在500rpm下离心5分钟。将来自10-20个
ii100cm"板的细胞沉淀重新悬浮于50ml水冷的裂解緩冲液(25mM Tris-HCl， pH 7.5， 2mM EDTA, 1% NP-40， lmM DTT， lmM PMSF)中。将细胞于水上 搅拌15分钟，然后在5000rpm下离心20分钟。
GST-标记蛋白的纯化将离心后的细胞裂解产物加载于2ml谷胱甘肽 -琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)上，并用10ml的25mM Tris-HCl， pH 7.5、 2mM EDTA、 lmMDTT、 200mM NaCl洗涤三次。GST-标记的蛋白经10次(每 次lml)25mMTris-HCl，pH7.5、 10mM还原的谷胱甘肽、100mMNaCl、 lmMDTT、 10%甘油洗提，并在-70匸下贮藏。
激酶测定对纯化GST-c-Kit进行酪氨酸蛋白激酶测定，终体积30jd, 含有200-1800ng酶蛋白(取决于比活性)、20mM Tris-HCl， pH 7.6、 3mM MnCl2、 3mMMgCl2、 lmMDTT、 10ftMNa3VO4、 5ng/ml聚(Glu， Tyr)4:l、 l%DMSO、 1.0jiMATP和0.1jiCi[y33pATP。通过对33P自[ 3pATP向聚 (Glu， Tyr)4:l底物的掺入进行测定，测定了在抑制剂存在或不存在下的活 性。在下述条件下，该测定(30nl)在室温下于96孔板中进行20分钟，通过 加入20^1 125mM EDTA终止测定。之后，将40jd反应混合物转移至 Immobilon-PVDF膜(Millipore， Bedford, MA，美国)上，该膜预先用甲醇浸 泡5分钟，用水洗涤，然后用0.5% H3P04浸泡5分钟并安装在与真空源 断开的真空歧管上。点入所有样品后，连接真空并用200^1 0.5% H3P04 洗涤每个孔。将膜取出，用1.0%11^04在振荡器上洗涤4次，并用乙醇洗 涤一次。将膜在环境温度下干燥后，安放在Packard TopCount96-孔框中 并加入10jil/孑L Microscint TM(Packard)进行计数。通it^"每个化合物一 式两份在四个浓度(通常为0.01、 0.1、 1和10liM)的抑制百分数进行线性 回归分析计算IC幼值。 一单位蛋白激酶活性定义为在37'C下每毫克蛋白每 分钟由[/3pATP向底物蛋白转移lnmole 33P ATP。
式I或II的化合物还抑制SCF-受体(和c-Kit，原癌基因)的自体磷酸 化。对SCF受体的自体磷酸化的抑制可以用例如M07e细胞测定，其为 依赖SCF增殖的人早幼粒细胞白血病细胞系。它们由美国的Grover Bagby, Oregon Health Sciences大学获得。将所述细胞在补充有10 FBS和2.5ng/mlGC-CMF的RPMI 1649培养基中进行培养。GM-SCF和SCF市售可得。 制备除去血清的M07e细胞并在37。C下用供试物质培养90分钟，然后在 37'C下用重组SCF刺激10分钟。用抗磷酸酪氨酸抗体通过蛋白质印迹分 才斤相同量的细胞裂解产物(Buchdunger等人，Proc. Natl. Acad. Sci (美国)92， 2558-62(1995))。用Amersham的ECL蛋白质印迹系统(Amersham，英国) 检测免疫修饰蛋白。
基于上述性质，式I或II的化合物不仅可用作抑制肿瘤的物质，例如 在小细胞肺癌中用作抑制肿瘤的物质，而且可用作治疗非恶性增殖性疾病 如动脉粥样硬化、血栓形成、4艮屑病、硬皮病和纤维变性的活性剂，以及 用于保护干细胞例如对抗化疗剂如5-氟尿嘧啶的血中毒作用和用于哮喘。 它特别可用于治疗对抑制PDGF受体激酶响应的疾病。
另外，式I或II化合物可预防用其它化疗剂的癌症治疗中的多药耐药 性的发生，或消除预先存在的对其它化疗剂的耐药性。除了上文所述的作 用外，式I或II化合物还可以有利地与其它抗肿瘤剂如特别是其它c-Kit 抑制剂和血管内皮生长因子(VEGF)受体或c-Scr活性抑制剂联用。
Abl激酶、特别是v-Abl激酶也被式I或II的化合物抑制。通过N. Lydon等人，Oncogene Research f, 161國173(19卯)和J. F. Geissler等人， Cancer Research ^， 4492-8(1992)的方法测定了对v-Abl酪氨酸激酶的抑 制作用。在这些方法中，使用[Val5-血管紧张素II和h^PIATP作为底物。
通过类推，式I或II化合物还可抑制Bcr-Abl激酶(参见Nature Medicine 2, 561-566(1996))，因此适合用于治疗Bcr-Abl-阳性癌和肿瘤疾 病，如白血病(特别是慢性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，其中特别 ;UL现了凋亡作用机制)，还可表现对白血病干细胞亚型的作用以及在取出 所述细胞(例如取出骨髓)后对这些细胞进行体外纯化并且一旦它们被清除 了癌细胞再将所述细胞^、(例如纯化的骨髓细胞再植入)的潜能。
抗c-Abl蛋白酪氨酸激酶的活性试验。所述试验以下述的滤膜结合试 验进行如Bhat等人，J. Biol. Chem. 221,16170-5(1997)所述，将c-Abl的 His-标记的激酶域克隆并在杆状病毒/Sf9系统中表达。以钴金属螯合物柱、继之以阴离子交换柱的两步操作纯化37kD的蛋白(c-Abl激酶)，产率为 l-2mg/L Sf9细胞。
考马斯蓝染色后经SDS-PAGE判断，c-Abl激酶的纯度〉卯。/。。检测 物含有c-Abl激酶(50ng)、 20mMTris HC1，pH7.5、 10mMMgCl2、 l(Him Na3V04、 1 mMDTT和0.06nCi/检测[y33p國ATP(5fim ATP)，使用30ng/ml 聚-Ala，Glu，Lys，Tyr-6:2:5:l(Poly-AEKY， Sigma P1152),含有1 %DMSO， 总体积为30nl。通过加入lOpl 250mM EDTA终止反应，将30^1反应混合 物转移至Immoblin-PVDF膜(MHIipore, Bedford, MA，美国)上，所述膜预 先用甲醇浸泡5分钟、用水洗涤，然后用0.5%H3PO4浸泡5分钟并安装 在与真空源断开的真空歧管上。点入所有样品后，连接真空并用200jil 0.5% H3PCV洗涤每个孔。将膜取出，用0.5。/。H3P04在振荡器上洗涤(4次)，并 用乙醇洗涤一次。将膜在环境温度下干燥后安放在Packard TopCoimt 96-孔框中并加入10fil/孔Microscint TM(Packard)进行计数。
抗Bcr-Abl活性试验。用p210 Bcr-Abl表达载体pGDp210Bcr/Abl (32D國bcr/abl)转染的鼠骨髓祖细胞系32Dcl3得自J. Griffin(Dana Faber Cancer Institute,波士顿，MA，美国)。该细胞表达具有组成性活性Abl 激酶的融合Bcr-Abl蛋白并独立地增殖生长因子。将细胞在RPMI 1640(AMIMED)、 10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Gibco)("完全培养基") 中扩增，通过在冰冻培养基(95 % FCS， 5% DMSO(SIGMA))中水冻每瓶2 xlO"个细胞的等分试样制备工作储备液。解冻后，将最多10-12次传代的 细胞用于试验。
对于细胞检测，将化合物溶于DMSO中并用完全培养基稀释至起始浓 度为10nM,然后用完全培养基制备连续3倍稀释液。在96孔圆底组织培 养板中每孔接种50jil完全培养基中的200，000 32D-Bcr/Abl细胞。 一式三 份地将每孔50jd受试化合物的连续3倍稀释液加入细胞。未处理的细胞用 作对照。将化合物与细胞一起在37°C、 5。/。C02下培养卯分钟，然后在 1300rpm(Beckman GRP离心机)上离心组织培养板，并小心地吸除上清 液，注意不要除去任何沉淀细胞。细胞沉淀通过加入150jd裂解緩冲液(50mM Tris/HCl， pH 7.4、 150mM氯化钠、5mM EDTA、 lmM EGTA、 1% NP-40、 2mM正钒酸钠、lmM PMSF、 50jig/mL抑肽酶和80jig/mL亮抑 肽酶)裂解并且立即进行ELISA或者于-20。C冷冻于板中保存待用。
将黑色ELISA板(Packard HTRF-96黑色板)在4'C用50ng/孔50^1 PBS中的来自Upstate的兔多克隆抗abl-SH3域Ab 06-466预覆过夜。用 含有0.05% Tween20(PBST)和0.50/oTopBlock(Juro)的200^1/孔PBS洗涤 三次后，剩余的蛋白结合位点用200nl/孔PBST， 3。/。TopBlock在室温下封 闭4h,然后用50nl未处理的裂解物或化合物处理的细胞(每孔20照总蛋 白)在4。C下培养3-4h。洗涤3次后，以50nl/孔加入用封闭緩冲液稀释至 0.2ng/mL的用碱性磷酸酶(Zymed)标记的抗磷酸酪氨酸Ab PY20(AP)并过 夜培养(4。C)。在所有培养步骤中，平板均用板盖(Costar)覆盖。最后，将 各平板用洗涤緩沖液再洗涤3次并用去离子水洗涤1次后，加入90jil/孔含 有Emerald II的AP-底物CDPStar RTU。此时将用Packard TopSealTM-A 板盖封闭的平板在黑暗中于室温下培养45分钟，并用Packard Top Count 微孔板闪烁计数器(Top Count)测量每秒计数(CPS)以定量发光。计算用未 处理的32D-Bcr/Abl细胞裂解物得到的ELISA-读数(CPS)与分析背景(所有 组分，但没有细胞裂解物)读数的差异并将其作为100%，其反应了这些细 胞中存在的组成性磷酸化Bcr-Abl蛋白。化合物对Bcr-Abl激酶活性的活 性表达为Bcr-Abl磷酸化的降低百分数。从剂量效应曲线通过图像外推法
确定ICso和IC9o值。
抗突变Bcr-Abl活性试验如上评估化合物对M351T突变体Bcr-Abl 激酶活性的活性，不同的是用突变Bcr-Abl转染的32Dd3细胞代替p210 Bcr-Abl 。
c-Raf-1蛋白激酶试验:通过GST-c-Raf-1重组杆状病毒和活性c-Raf-1 激酶生成所需的v-Src和v-Ras重组杆状病毒三重感染SOI细胞得到重组 c画Raf-l蛋白(Williams等人，PNAS 1992; 89:2922-6)。需要活性Ras(v-Ras) 将c-Raf-1募集到细胞膜，需要v-Src将c-Raf-1磷酸化以完全将其活化。 将细胞以2.5 x 107个细胞/150 mm盘接种并允许在室温下附着于150mm盘达1小时。吸取培养基(含有10%FBS的SF900II)并分别以MOI 3.0、 2.5和2.5、总体积4-5 mL加入重组杆状病毒GST-c-Raf-l 、 v-Ras和v-Src。 将细胞室温下培养1小时后加入15mL培养基。感染的细胞在27'C培养 48-72小时。刮除感染的Sf2细胞并收集至50mL管中并在Sorvall离心机 中以1100g在4。C下离心10分钟。用水冷的PBS洗涤细胞沉淀并用0.6mL 裂解緩冲液/2.5xl(^个细胞裂解。在水上10分钟、伴偶尔吹吸后，使细胞 达到完全裂解。在具有SS-34旋转子的Sorvall离心机中以14，500g在4匸 下离心细胞裂解物IO分钟，将上清液转移到新管中并保存于-80'C。每2.5 x 107个细胞使用100nl在冰冷的PBS中平衡的填装谷胱甘肽-琼脂糖4B 珠从细胞裂解物纯化c-Raf-l。摇动下使GST-c-Raf-l在4匸下与珠结合1 小时。将与珠结合的GST-c-Raf-l转移到柱子。该柱用裂解緩沖液洗涤l 次并用水冷的Tris緩冲液洗涤2次。加入水冷的洗脱緩冲液并中止柱流以 允许游离谷胱甘肽破坏GST-c-Raf-l与谷胱甘肽琼脂糖珠的相互作用。收 集级分(lmL)至预冷的管中。每管含有10%甘油(终浓度)以在冷冻融解循 环中保持激酶活性。将纯化的GST-c-Raf-l激酶蛋白级分保存于-80'C下。 IkB用作c-Raf-l激酶的底物。IkB在细菌中表达为His-标记的蛋白 BL21。使含有IkB质粒的LysS细菌在LB培养基中生长至OD600 0.6， 然后用IPTG(终浓度1 mM)在37t:诱导3小时使细菌表达IKB ,然后通 过在超声緩冲液(50 mM Tris pH 8.0、 lmM DTT、 lmM EDTA)中超声 (microtip设定每次1分钟，共3次)溶菌并以10,000g离心l5分钟。将上 清液与硫酸铵混合得到终浓度30% 。将该混合物在4X:摇动15分钟然后以 10,000g旋转15分钟。将沉淀重新悬浮于含有10 mM BSA的结合緩冲液 (Novagen)中。按照Novagen手册该溶液加载于Ni-琼脂糖(Novagen)并洗 涂。用洗脱緩冲液(0.4M咪唑、0.2MNaCl、 8mM Tris pH 7.9)自柱中洗 脱IkB。将含有蛋白质的级分在50 mM Tris pH8， lmM DTT中裂解。通 过测量33P自[ 3P]ATP向IkB中的掺入，测定在抑制剂存在或不存在时的 c-Raf-l蛋白激酶的活性。该分析在96孔板中于室温下进行60分钟。其含 有(总体积30pl): c-Raf-l激酶(400ng)、 25 mM Tris.HCl, pH 7.5、 5mMMgCl2、 5mM MnCl2、 lOpM Na3V04 、 ImM DTT和0.3^0/检测 [ 3p誦ATP(10nMATP)，使用600nglKB，含有l%DMSO。通过加入lOjil 250 mM EDTA终止反应并将30jil反应混合物转移至Immobilon-PVDF膜 (Millipore, Bedford, MA,美国)上，所述膜预先用甲醇浸泡5分钟、用水 洗涤，然后用0.5% H3P04浸泡5分钟并安装在与真空源断开的真空歧管 上。点完所有样品后，连接真空并用200^10.5% H3P04洗涤每个孔。除去 膜并在振荡器上用0.5% H3P04洗涤4次，用乙醇洗涤1次。室温干燥后， 将其安装在Packard TopCount 96孔框中，并加入lOjil/孔 MicroscintTM(Packard)，对膜进行计数。
现已惊讶地发现由于在细胞特别是在肿瘤细胞和在大脑中的生物还 原作用(脱氧)，我们的式I或II化合物具有出乎意料的潜能，可用作缺氧-逸捧性产品。缺氧激活的前体药物可特别用于癌症治疗，因为在实体瘤或
大脑中发生严重缺氧。缺氧细胞可用于非毒性、缺氧激活的前体药物的治 疗。因此，由于N-氧化物部分的净还原作用，在肿瘤或大脑中存在式I或 II化合物的较高摄入，并且在肺瘤或大脑中存在还原形式的式I或II化合 物的蓄积。
式I或II化合物的另一优势是相对于化合物A对载体介导的外流(通 过可饱和的系统，可能是P-gp)具有优异的作用。该不明显的外流的结果 是
-更多的吸收；
-在大脑中更高的药物水平和
-在肺瘤中更高的药物水平。
对P-gp的作用和转运4几制可证实如下
用在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)滤器(Falcon TM)上生长21-25天的 Caco-2细胞单层进^f亍转运实验。在存在或不存在强外流泵抑制剂CsA和 维拉帕米的条件下，分别测定化合物通过生长在PET滤器上的Caco-2细 胞单层以及通过无Caco-2细胞的单独的PET滤器(用于系统斷￡)的流出， 方法如下在转运实验之前，用预先在37。C培养的接收溶液(HBSS，需要时含有目标抑制剂)代替接受池中的培养基(顶侧0.21111，底侧1.0ml)。为了 启动实验，用预先在37。C培养的供体溶液(处于HBSS中的化合物，需要 时含有目标抑制剂)代替供体池中的培养基(顶部0.351111，底侧1.15ml)。约 1和120分钟后从供体和受体侧取150jil等分试样。在37。C下、于未经振 摇的培养箱内、 一式三份地进行顶侧-至-底侧和底侧-至-顶侧两个方向的转
运实验。
此夕卜，式I或II化合物的血浆蛋白结合在游离部分和/或与血浆蛋白(例 如白蛋白、a-l-酸性糖蛋白(AAG))的締合方面M于用化合物A所观察到 的。与AAG较低程度的締合导致N-氧化物的游离部分的可变性较不显著 并且也对游离部分的化合物A有影响。在400 mg日剂量的临床相关剂量 (浓度为900-2600 ng/mL的化合物A)下，化合物A的游离部分为4 - 5 % 。 4吏用红血球分配，发现化合物A主要与白蛋白和oc-l-酸性糖蛋白(AAG) 締合。与脂蛋白和Y球蛋白締合的部分小于5。/。。降低的式I或II化合物 的血浆蛋白结合通过下面的实施例显示。
通过超离心方法确定式I或II化合物的游离(或未结合)部分，该方法 也用于化合物A(见2000年12月22日提交的欧洲专利申请No.l250140或 国际专利申请WO 01/47507)。将用含有0.9% NaCl(w/v)的Soerensen緩冲 液(pH7.4)制备Ajk清白蛋白(40g/L)和a-l-酸性糖蛋白(l g/L)溶液。将30nl 式I或II化合物的储备液直接加到3 mL蛋白溶液中以得到期望的终浓度， 即300-5000 ng/mL式I或II化合物(乙醇终浓度0.5%,系数1:200)。在恒 定的轻微搅动下于37。C培养30分钟，所加的蛋白样品(11=3/4)在37"C下使 用厚壁聚碳酸酯离心管以200，000g离心至少5小时(带有固定角度旋转子 的离心机)。不经制动4吏旋转停止。测定培养后(离心前)和离心后在上清液 中的式I或II化合物的浓度。
式I或II化合物的药物动力学在C皿(〗见察到的以质量/体积为单位的 血浆最高浓度)、半衰期(指施用药物后观察到所测量的药理学应答减小一 半的时间； 一方面，当半衰期增加至少50%时，半衰期,皮延长)或者作为 一种转运^L制(例如P-gp)的血浆AUC(随时间变化的血浆浓度，定义为曲线下面积(AUC)，以质量-时间/体积为单位)要优于化合物A。通过对动物(例 如大鼠)施用单剂量的式I或II化合物(一组动物静脉内处理， 一组动物经 口服处理)可证明该有利的药物动力学。在选定的时间点(例如0.083分钟(iv: 静脉内))和iv或po(经口月艮给药)后0.25、 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24和48h :fsuk。通过将血离心立即制备血浆。用HPLC/UV检测或LC-MS 测定血浆中未改变的式I或II化合物和化合物A。
此外，式I或II化合物与血浆蛋白的结合减少可导致表观分布容积的 增加，原因是未结合药物(fu)的比例升高。有利的是，式I或II化合物在 器官和组织(包括脑)的分布与化合物A不同。这可显示如下。 -用未放射性标记的N-氧化物给药时小鼠或大鼠脑中的式I或II化合物和 化合物A。
动物(例如小鼠或大鼠)接受单剂量的式I或II化合物(一组动物静脉内 处理， 一组动物口服处理)。在选定的时间点(例如0.083(iv)和iv或po给药 后l、 8、 24和48小时)将动物处死。取出经处理的动物的脑，制备脑匀浆 并制备样品(例如用有机溶剂如甲醇、乙腈等萃取匀浆)用于式I或II化合 物或化合物A的分析(HPLC/UV或LC-MS)。测量脑和血浆中式I或II化 合物和化合物A的浓度以确定脑/血浆比。
-用放射性标记的N-氧化物给药时小鼠或大鼠中的》文射性物质分布。
对于组织分布研究，例如将10 mg/kg的》史射性标记的N-氧化物(例如 ["C-标记；100jiCi/kgb.w.)口月良施用于动物。用定量全身自放射发光绘图 法(QWABL)研究放射活性物质在动物全身的吸收/分布。在选定的时间点 处死动物并在约-75匸的干水和己烷的混合物中冷冻。将冷冻的动物包埋入 预冷的约-75t:的2Q/。Na-CMC水性凝胶中；在约-20"C下用CryoMacrocut 低温切片机(Leica Instr. GmbH， D-Nussloch)获得40jim厚的切片。使切片 在低温切片机中于-23 °C下脱水24-60h。在铅屏盒中于室温下将切片暴露于 BAS III成《綠(Fuji Photo Film有限公司，日本，东京)l天以使背景增加 最小。暴露的时间允许检测约2 dmp/mg，即相应于总放射活性剂量(如果 放射活性平均分布于全身)约0.2-0.4%的放射活性浓度。曝光结束后立即在
19Fuji BAS 2000 TR磷成像4义中、在控光条件下以100jim扫描步幅1024 灰度等级进行扫描。图像分析如下进行将所得光刺激的光数据文件通过 减去背景进行校正，借助MCID/M4(3.0Rev丄3)图像分析仪(Imaging Research, St. Catherines, Ontario,加拿大)对文件进行电子处理，并利用在 和样品类似条件下处理的放射活性血标得到的1次多项式校正曲线将其自 动转变成放射活性浓度。通过LD-背景平均(n-10)+3SD、 QI^3LD确定检 测限(LD)和定量限(QL)。
测量面积的大小和用于设定校正曲线的血标的每个血标准相同。用 Adobe Photoshop⑧软件处理图像文件。
对于使用QWABL获得的总放射活性物质的分布，只使用一半经处理 的动物，这使得可能使用器官或组织以在选定的样品中用HPLC/UV或 HPLC-放射活性和/或LC-MS中测定未改变的N-氧化物和/或化合物。
由于N-氧化物更具极性，式I或II化合物对CYP450也具有较低的 亲和力[1，2。这些酶代谢大部分市售药物。较低的亲和力表示较小的药物/ 药物相互作用的可能性。特别是阻断碱性氮如哌溱/吡咬部分中的碱性氮可 降低对CYP2D6的亲和力，CYP2D6是一种特别是通过与天冬氨酸残基的 离子相互作用与底物结合的酶，所勤目互作用需要碱性部分如哌溱环系统 中的氮。将10种不同的人肝微粒体与所有其代谢活性(NADPH)必需的辅 因子以及各个CYP450同工酶特异活性所必须的确定的标记底物一起培 养。以递增浓度加入可能的抑制剂，并用相应的分析方法(LC/MS、 HPLC、 荧光法)评价代谢反应。将无抑制剂的转化率设定为100%,以抑制50%转 化所需的抑制剂浓度(IC50)评价抑制率。使用了以下的标记底物
底物CYP优选的可接受的
1A2乙^&试卤灵咖啡因(低周转)
(ethoxyresorufin)茶碱(低周转)
非那西丁乙酰苯胺(在肝细胞中使用最多)
曱氧基试囟灵(methoxyresorufin)2A6香豆素
2C8紫杉醇(标准有效性？)
2C9S-华法林 双氯芬酸曱絲丁脲(低周转)
2C19S-甲妥因(4-羟基代谢物) 奥美拉唑
2D6丁呋洛尔美托洛尔
右美沙芬异会胍 可待因(均无问题，但不常使用)
2E1氯唑沙宗4-硝基苯酚 月桂酸
3A4咪达峻仑硝苯地平
睾酮(强力推荐使用至少两种非洛地平
结构不相关的底物)环孢菌素 特非那定 红霉素 辛伐他汀
另外，式I或II化合物在治疗移植例如同种移植引起的疾病中表现出
有益作用，特别是组织排斥反应，如特别是闭塞性细支气管炎(OB),即同 种肺移植物的慢性排斥反应。与无OB的患者相比，那些患有OB的患者 常常表现出支气管肺泡灌洗液中的PDGF浓度升高。如果将式I或II化合 物例如以50mg/kg的劇度内剂量施用于具有气管同种移植物的大鼠，在10 和30天后，每组切除10个移植物后对可能的上皮损害和气道闭塞进行形 态测定分析并研究作用的免疫组织化学通路可以证实尽管式I或II化合 物对上皮坏死或炎性细胞浸润没有显著效果，但是与对照相比较其确实显 著减少管腔的纤维增殖和闭塞。与其它免疫调节物质或抗炎物质的协同作 用是可能的，例如当与以下物质联合4吏用时环孢菌素A(CsA)、雷帕霉素 或子嚢霉素或其免疫抑制类似物，例如环孢菌素G、 FK-506或相当的化合 物；皮质类甾醇；环磷酰胺；疏唑嘌呤；甲氨喋呤；白瑞夸尔；来氟洛米；
21咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸酯；15-脱氧斯潘格宁；免疫抑制抗体，特别是 白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、 CD2、 CD3、 CD4、 CD7、 CD25、 CD28、 B7、 CD45、 CD58或它们的配体；或其它的免疫调节化合物，如 CTLA4Ig。如果CsA(lmg/kg皮下施用)例如与式I或II的化合物(50mg/kg) 联用，可以观察到协同作用。
式I或II化合物对与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(其中 PDGF和PDGF受体也常发挥作用)也有效，如再狭窄和动脉粥样硬化。 这些对体外和体内血管平滑肌细胞增殖或迁移的作用及其结果可通过施用
式I或II的化合物以及通过研究其对体内机械损伤后血管内膜肥厚的作用 来证实。
式I或II的化合物在0.1N HC1或DMSO中以lOmM的浓度用于体外 研究。贮备液用细胞培养基进一步稀释并以10至O.lnM的浓度用于实验。 对于体内施用，将式I或II化合物溶于例如DMSO中，浓度为200mg/ml， 然后用1%吐温的0.9%盐水溶液进行1:20稀释。超声后，获得透明的溶 液。施用前每天制备新鲜的贮备液。(也可以将式I或II化合物简单地溶于 去离子水中用于口月施用，或溶于0.9%的盐水溶液中用于胃肠外施用)。 在手术前24小时进行施用。在整个观察期间，将式I或II化合物以每天 50mg/kg自内给药剂量单剂量施用于大鼠。对照大鼠给予相同的制剂， 但不含有式I或II化合物。口月良施用也是可能的。
用Thyberg等人(参见Differentiation ^， 156-67(1983))所述的方法的 改进方法由9至11天龄的DA(AG-B4， RTla)大鼠主动脉分离平滑肌主动 脉细胞的原代培养物。通过纵向切割打开主动脉并小心地除去内皮。分离 外膜和中膜，并将中膜在37t:下于磷酸盐緩冲的生理盐水中用0.1%的胶 原酶和脱氧核苷酸酶消化30分钟。将细胞离心、悬浮于培养基中，然后使 其在塑料瓶中生长。2至6次传代后用初级细胞进行实验。将传代培养物 保存在补充了 10%胎牛血清、2mmol/ml谷氨酰胺、100mmol/ml链霉素和 100IU/ml青霉素的DMEM(Dulbecco，s Modified Eagle，s培养基)中。出于 鉴别目的，将细胞放置于盖玻片上使其生长并用由平滑肌细胞获得的抗-a-肌动蛋白抗体进行免疫组织化学染色(见下文)。
用上下池,皮孔径为8nm的聚碳酸酯膜分开的Transwell细胞培,入 物(Costar， Cambrige， MA)对平滑肌细胞的迁移进行体外定量。将细胞 (lOOjil，浓度为1百万个细胞/ml)暴露在上池中。2小时后，向下侧池中加 入60ng/ml PDGF誦BB或PDGF-AA(Upstate Biotechnology 乂〉司，Lake Placid,纽约)，补充0.5%胎牛血清和0.1%牛血清白蛋白，并以浓度3、 1、 0.3、 0.1、 0.03、 0.01和0.003jiM加入式I或II的供试化合物。为了测定 纤连蛋白依赖性迁移，在4'C下用浓度为10pg/ml的纤连蛋白(人细胞纤连 蛋白，Upstate Biotechnology 乂>司)覆盖Transwell腔室。迁移24小时后， 将滤器取出，在曱醇中固定并用迈尔苏木精和曙红染色。借助放大400x 的光学显微镜对滤器上的特定截面区域进行计数，以测定滤膜下侧迁移的 细胞。用与对照相比的细胞百分数对迁移抑制进行定量。为了排除毒性作 用的可能性，通过在补充了 10%胎牛血清的DMEM中掺入3H-胸苷对细 胞的生存力进行试验。观察式I或II化合物对PDGF-AA和特别是 PDGF-BB诱发的迁移的抑制作用。
实验动物剥离雄性Wistar大鼠(购自赫尔辛基大学实验动物中心， 芬兰)的主动脉和颈动脉。腹膜内施用240mg/kg的水合氯醛将大鼠麻醉， 并施用丁丙诺啡(Temgesic， Reckitt&Coleman， Hull，英国)用于减轻手术期 间的和手术后的疼痛。按照NIH的"实验室动物管理法则"和"实验室 动物管理和使用指南"(NIH公告86-23， 1985年修订)对所有动物给予人 性管理。使用重200-300g的大鼠进行剥露操作。通过使2F栓子切除术导 管(Baxter Healthcare公司，Santa Ana， CA， 27)在管腔内通过剥离左側 颈总动脉内皮。为了除去内皮，使导管通过管腔三次，导管用0.2ml空气 膨胀。取出导管后结扎颈外动脉并缝合伤口。剥离后4天参照颈动脉中部 截面评价组织学变化。用2FFogarty动脉栓子切除术导管剥离胸主动脉内 皮。将导管经左侧髂动脉插入胸主动脉、用0.2ml空气膨胀，并通过管腔 5次以除去内皮。然后将髂动脉拮扎。选择三个时间(3、 7和14天)评价组 织学变化。为了对增殖细胞进行定量，剥离大鼠颈动脉后使用3种不同方法用溴 脱氧尿苷(BrdU)标记细胞。在该模型中，剥离后24小时血管中层细胞开 始增殖；72-96小时后首次出现内膜细胞。为了在出现内膜细胞之前对平 滑肌细胞的增殖进行定量，在剥离后0至72小时的术后期间静脉内施用 O.lml BrdU-标记的试剂(ZYMED， San Francisco, CA)(共计施用6次 O.lml)。为了在迁移初始波期间对增殖进行定量，在手术后72-96小时期 间以8小时间隔给予大鼠3x0.1mlBrdU-标记的试剂。为了在迁移初始波 末期对增殖进4亍定量，处死前3小时给予第三组大鼠0.3ml BrdU的脉冲剂
将组织学样本在3 %的多聚曱醛溶液中固定4小时以在石蜡中进行包 埋。由迈尔苏木精-曙红染色的石蜡切片评价形态学变化。在400x放大下 计算不同脉管切片的细胞数。为了鉴别培养物中的细胞和剥离损伤4天内 新内膜中出现的细胞，用由平滑肌细胞获得的抗-a-肌动蛋白抗体 (Bio-Makor, Rehovot，以色列)对丙酮固定的样本进行免疫组织化学染色。 在丙酮固定的盖玻片上用相同的染色方法鉴别初级平滑肌细胞。将切片与 初级抗体(1:2000稀释)一起培养、洗涤并连续与和过氧化物酶偶联的兔-抗 鼠-Ig和羊-抗兔-Ig —起培养，然后用含色原3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化 氬的底物溶液处理。用初级鼠抗体(Bu20a, Dako， A/S，丹麦)和Vectastain Elite ABC画Kit(Vector Laboratiories, Burliname， CA)由石蜡切片制备 BrdU染色。将切片去除石蜡并用500W的微波处理(在0.1M的柠檬酸盐 緩沖液，pH6中处理2x5分钟)，然后在70。C下用95%的甲酰胺的0.15M 柠檬酸三钠溶液处理45分钟。根据生产商的说明书制备抗体稀释液。用迈 尔苏木精和曙红进行复染，对内膜、中层和外膜的正染色细胞分别进行计 数。
在经处理动物的颈动脉中，发现平滑肌细胞的细胞数显著减少。外膜 和血管中层显示出细胞数的显著减少。由于式I或II化合物，在最初两个 标记期间(0-72和72-96小时)发现内膜、中层和外膜中BrdU标记的细胞的 绝对数量略孩史减少，93-96小时后发现所有区域中的标记细胞数量减少。在剥离动脉的动物中也同样发现了平滑肌细胞数量减少。
因此，根据这些发现，式I或II化合物可以抑制血管平滑肌细胞的增 殖，以及特别是迁移。
式I或II化合还能抑制血管生成。这可以证实如下将含琼脂(0.8% 和肝素(2U/ml)的小室皮下植入正常小鼠(C57 BL/6)中，同时^V或不^iA 生长因子(VEGF 3ng/ml， PDGF ljig/ml或bFGF 0.3將/ml)。以在棵鼠异 种移植物模型中以表现出良好抗肺瘤活性的剂量口月艮施用式I或II化合 物。在植入小室前一天开始给药。5天后将小室取出。通过测定在^物 周围生长的血管化组织和该组织的血容量(夕卜部血)对血管生成功效进行定 量。通过测定血红蛋白对血液进行测定。尽管脉管没有生长进入琼脂，但 如果存在抗血管生成作用，琼脂将变得非常红。如果化合物抑制生长因子 i秀发的血液增加，可将此视为所试验的化合物可阻断相关生长因子的血管 生成作用的表现。抑制血液的重量而不是体积显示对成纤维细胞增殖的作 用。对对照响应的抑制显示对伤口愈合的抑制。在每天一次50mg/kg的口 服剂量下，式I或II化合物可抑制所有三种生长因子(VEGF、PDFG、bFGF) 的血管生成作用。
有趣的是，发现4-[(4-曱基-l-哌溱基)-甲基-N-(4-羟曱基-3-[4-(3-吡啶 基)-2-嘧啶基]-氨基1-苯基}-苯甲酰胺、4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌溱基)-甲 基]-N-(4-甲基-3-[[4-(3-吡^0-2-嘧"^l-氨基-苯基卜苯甲酰胺和4-[(4-甲 基-l-派溱基)-甲基-N-[4-甲基-3-[[4-(l-氧化-3-吡咬基)-2-嘧吱基l-氨基]-苯 基l-苯甲酰胺代表N-[4-甲基-3-(4-吡咬-3-基-嘧咬-2-基氨基)-苯基-4-(4-甲 基-哌漆-l-基曱基)-苯甲酰胺(ST1571或伊马替尼，下文称为化合物A)的代 谢物，其在施用化合物A后可在人体中发现。化合物A在EP 0564409B1 中述及，并且在WO 99/03854中述及甲磺酸盐形式。
除以上提及的代谢物外，其它化合物A的代谢物在猴中被鉴定，如 4-[(4-甲基羰基-l-哌嗪基)-甲基I-N-H-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基j-氨 基-苯基}-苯甲酰胺；4-[(4-甲基-l-哌嗪基)-甲基l-N-(4-羧基-3-[[4-(3-吡啶 基)-2-嘧錄-絲-苯基}-苯甲酰胺；4-絲-N-(4-甲基-3-[4-(3-吡錄)國2画嘧啶基I-氨基卜苯基卜苯甲酰胺；4-[(4-甲基-l-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基 -3-[[4-(3-吡錄)-2-嘧^^-氨基]-苯基1-苯甲酰胺，其中吡錄部分在一个 环碳原子上被羟基取代；以及4-[(l-派溱基)-甲基-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶 基)-2-嘧咬基-氨基-苯基-苯甲酰胺，其中吡^部分在一个环碳原子上被 羟基取代。
优选的是如下的式II化合物，其中
Ri为氢，
R2为甲基或羟甲基， R3为甲基，且
星号指示任选地带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子，
条件是如果R2为曱基，则用星号标记的三个氮原子中的至少一个带 有氧原子， 或所述化合物的盐。
特别优选的还有如下的式II化合物，其中
R为氢，
R2为羟基-低级烷基，
R3为甲基，且
星号指示任选地带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子， 或所述化合物的盐。
特别优选的是选自以下的化合物4-[(4-甲基-l-P底嗓基)-曱基l-N-(4-羟 甲基-3-[[4-(3-吡紹+2-嘧咬基-氨基-苯基}-苯甲酰胺、4-[(4-甲基-4-氧化 -l-哌嗪基)-甲基-1\-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基-苯基}-苯甲 酰胺和4-[(4-甲基-l-派溱基)-甲基-N-[4-甲基-3-[[4-(l-氧化-3-吡^)-2-嘧 咬基卜氨基卜苯基卜苯甲酰胺，以及这些化合物的可药用盐。
非常特别优选的还有以下实施例中提及的式I或II化合物或其盐，特 别是其可药用的盐。
尽管以前没有对制备式I或II化合物的描述，但是式I或II化合物或 其盐可根据本身已知的方法制备，特别是用以下方法
26(a)使式III4匕合物
其中R:和R2具有式I下给出的含义， 与式IV化合物反应，
其中A具有式I下给出的含义，
并将由此获得的化合物用适宜的氧化剂转化为式I的N-氧化物，或者如果 不转化为N-氧化物，A就必须在环碳上被氧代基取代； 优选地，使式III化合物
N、
其中R,和R2具有式II下给出的含义，且星号指示任选地带有氧原子的氮 原子，
与式IV化合物反应，其中R3具有式II下给出的含义，且星号指示任选地带有氧原子的氮原子; 并任选地将由此获得的化合物用适宜的氧化剂转化为式II的N-氧化物；
或
(b)使式V4匕合物
其中R，和R2具有式I下给出的含义，Hal为卤素(例如-Cl、 -Br、 -F、 -1)， 与式VI化合物反应，
AH (VI) 其中A具有式I下给出的含义，
并任选地将由此获得的化合物用适宜的氧化剂转化为式I的N-氧化物； 优选地，使式V化合物其中！^和R2具有式II下给出的含义，Hal为卤素(例如-Cl、 -Br、 -F、 -1)，
且星号指示任选地带有氧原子的氮原子， 与式VI化合物反应，
HN* NT—R, (VI),
其中R3具有式II下给出的含义，且星号指示任选地带有氧原子的氮原子； 并任选地将由此获得的化合物用适宜的氧化剂转化为式II的N-氧化物；
其中存在于方法a)或b)的起始化合物中并且不应参与反应的官能团必 要时以被保护的形式存在，并且将存在的保护基裂解，其中所述的起始化 合物也可以以盐的形式存在，条件是存在成盐基团且盐形式的反应是可能 的；
并且如果需要，将方法a)或b)获得的式I或II化合物转化为另一种式 I或II化合物，将所得的游离式I或II化合物转化为盐，将所得的式I或 II化合物的盐转化为游离化合物或另一种盐，和/或将式I或II的异构体化 合物的混合物拆分为单独的异构体。
在最优选的实施方案中，式I或II化合物为基本上纯的形式。 在本发明的上下文中，术语"基本上纯的"应理解为意指基本上不含 生物学物质，如在血中发现的生物学物质，特别是所述生物学物质少于 10%、优选少于1%，且最优选不含所述的生物学物质。
方法变体描述
用于将方法a)或b)所得的化合物转化为式I或II的N-氧化物的适宜 氧化剂优选为过氧化氢或适宜的过酸，例如适宜的过苯甲酸，如特别是间-氯-过苯曱酸。该反应在如下条件下进行在惰性溶剂中，例如卣化烃如二 氯甲烷；在约-20n至所述溶剂沸点的温度下，通常低于+ 100t:。如果使 用过氧化氩作为氧化剂，该反应优选在水中、约室温下进行。然后可以用 常规方法如例如柱色镨法或重结晶法纯化所需的N-氧化物。另 一方面，式I或II的N-氧化物可以根据前段所述的方法、通过先行 氧化式I或II化合物合成中所用的起始原料制备。
关于方法a):
式III化合物和式IV化合物之间的反应优选在适宜的惰性溶剂、特别 是N，N-二甲基甲酰胺中、于丙膦酸酐(Fluka，Buchs，瑞士)和碱如特别是三 乙胺存在下、优选在室温下进行。
关于方法b):
式V化合物和式IV化合物之间的反应优选在适宜的惰性溶剂中、特 别是醇例如低级醇如特别是乙醇、于升高的温度下、优选接近所用溶剂的 淬点温度下进行。
式V化合物中存在的卣素为例如氟、氯、溴和碘，优选氯。
其它方法步骤
在根据需要进行的其它方法步骤中，起始化合物中不应参与反应的官 能团可以以未保护的形式存在或可以例如,皮一个或多个保护基保护。然后 才艮据已知方法之一全部或部分地除去保护基。
保护基和它们被引入和除去的方法在以下文献中述及例如"有机化 学中的保护基"，Plenum出版社，伦敦，纽约1973;和"Methoden der organischen Chemie，， ， HoubenWeyl,第4版，第15巻/1， Georg-Thieme -Verlag,斯图加特1974以及Theodora W. Greene,"有机合成中的保护基"， John Wiley & Sons,纽约1981。保护基的特征在于它们可例如通过溶剂 分解、还原、光解或者备选地在生理M容易地除去，即不发生不期望的 副反应。
但是，式I或II的终产物也可以含有在用于制备式I或II的其它终产 物的起始原料中也可用作保护基的取代基。因此，在本文范围内，除非上 下文中另外说明，否则只有不构成式I的具体所需终产物的、易于除去的基团才被称为"保护基"。 一般方法条件
在此所述的所有方法步骤均可在已知反应条件下进行，优选在那些特 别提及的条件下进行，不存在或通常存在溶剂或稀释剂，优选那些对所用
试剂呈惰性且能溶解它们的溶剂或稀释剂；不存在或存在催化剂、缩合剂 或中和剂，例如离子交换剂，通常是例如质子化(11+-)形式的阳离子交换剂， 这取决于反应和/或反应物的类型；温度为降低的、正常的或升高的温度， 例如-100'C至约190'C、优选约-80"C至约150。C，例如-80'C至-60匸下、RT、 -20'C至4(TC、 0匸至IOO'C或所用溶剂的沸点；如果需要在压力下进行， 压力为大气压力或在密闭容器中；和/或在惰性气氛例如在氩气或氮气中。
本发明还涉及这样的方法实施方案其中，从在任何阶段作为中间体 可荻得的化合物开始并且进行余下的步骤，或在任何阶段中断方法，或在 反应条件下形成起始原料，或4吏用活性f汙生物或盐形式的所述起始原料， 或生成在这些方法条件下用本发明的方法可获得的化合物，并进一步对所 述的化合物进行原位处理。在优选的实施方案中，Jl应由那些生成前述优 选化合物的起始原料开始。
在优选的实施方案中，式I或II化合物根据实施例中定义的方法和方 法步骤制备。
式I或II化合物，包括它们的盐，也可以以水合物形式获得，或者它 们的晶体可以包含例如用于结晶的溶剂(以溶剂合物形式存在)。
起始原料
新的起始原料和/或中间体及其制备方法同样是本发明的主题。在优选 实施方案中，使用了所述的起始原料，并对反应条件进行了选择以便能获 得优选化合物。
上述方法中所用的起始原料是已知的、可根据已知方法制备(也可参见 EP 0564409Bl)或市售可得；具体而言，它们可以用实施例中所述的方法
31制备。
在起始原料的制备中，必要时对不参与反应的现有官能团进行保护。 优选的保护基、它们的引入和除去在上文中或在实施例中描述。也可以用 其盐代替各个起始化合物和过渡物进行反应，条件是存在成盐基团且用盐 进行的反应是可能的。当在上下文中使用术语起始原料时，其盐也总是被 包括在内，只要是合理的和可能的即可。
其中R2为低级烷基且用星号标记的氮原子不带有氧原子作为取代基 的式III化合物可以如EP0564409B1所述进行制备。然后，如以上"方法 变体描述"下所述，可以用适宜的氧化剂将所述化合物转化为相应的N-氧化物。
其中R2为羟基-低级烷基的式III化合物可以用类似于实施例1的方法 由以下的式VII化合物开始制备
(VII).
、低级烷基-COOH
其余的起始原料是已知的、可以才艮据已知方法如例如EP 0564409B1 中所述的那些方法制备或市售可得；或者具体而言，它们可以用实施例中 所述的方法制备。为形成相应N-氧化物的适宜的N-苯基-2-嘧咬-胺衍生物 也在例如EP0564409B1中述及。
本发明还涉及用于治疗患有所述疾病、特别是肿瘤疾病的、包括人在 内的温血动物的方法，其中向需要所述治疗的包括4内的温血动物施用 可有效对抗相关疾病量的、特别是具有抗增殖和特别是抑制肿瘤功效的量 的式I或II化合物。此外，本发明还涉及式I或II化合物用于抑制上述酪 氨酸激酶、特别是PDGF受体激酶、v-Abl激酶和/或c-Kit受体激酶的用 途，或在制备用于治疗包括人在内的温血动物、特别是用于治疗肿瘤如神 经胶质瘤、卵巢肿瘤、前列腺肺瘤、结肠肿瘤和肺部肿瘤如特别是小细胞 性肺癌、以及乳腺肿瘤或其它妇科肿瘤的药物组合物中的用途。根据种属、 年龄、个体状况、施用方式和相关临床情况，可向约70kg体重的、包括人在内的温血动物施用有效的剂量，例如约l-2500mg、优选l-1000mg、 特别是5-500mg的日剂量。
因此，另一方面，本发明涉及其中至少一个氮原子带有氧原子以形成 相应N-氧化物的N-苯基-2-嗜咬-胺衍生物或所述化合物的可药用盐在制备 用于治疗增殖性疾病的药物组合物中的用途。
优选地，本发明涉及式I或II化合物或所述化合物的可药用盐在制备 用于治疗增殖性疾病的药物组合物中的用途。
最优选地，增殖性疾病选自肿瘤或脑增殖性疾病。
本发明还提供了用于治疗包括人在内的温血动物的方法，其包括以有 效对抗所述疾病的剂量向所述的患有增殖性疾病的温血动物施用式I或II 化合物或所述化合物的可药用盐。
在另一项实施方案中，本发明提供了包含至少一种其中至少一个氮原 子带有氧原子以形成相应的N-氧化物的N-苯基-2-嘧咬-胺衍生物或其可药 用盐以及可药用载体的药物组合物。
优选地，本发明提供了包含式I或II化合物或其可药用盐以及可药用 载体的药物组合物。
本发明的组合物可含有至少一种其它的药学活性化合物如4-(4-甲基 派嚷-l-基曱基)-N-[4-甲基-3-(4-吡咬-3-基)嘧咬-2-基^J^苯基-苯甲酰胺。
优选地，用于在包括人在内的温血动物中治疗增殖性疾病的药物组合 物，包含式I或II的化合物或所述化合物的可药用盐作为活性成分，以及 可药用的载体。
因此，本发明还涉及包含式I或II化合物作为活性成分以及可药用载 体的药物组合物，其特别用于预防或治疗所述疾病之一，所述的药物组合 物适合于例如局部、经肠例如口月艮或直肠、或胃肠外施用。用于口月l施用 的特别是片剂或明胶胶嚢剂，其含有活性物质以及稀释剂，例如乳糖、右 旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油，和/或润滑剂，例如 二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钩，和/或聚乙 二醇。片剂也可以含有粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，以 及如果需要，还含有崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是藻 酸钠，和/或泡腾混合物或吸附剂、着色剂、芳香剂和甜味剂。本发明的药 理学活性化合物还可以以用于胃肠外施用的制剂或输注溶液形式使用。所 述溶液优选为等张水溶液或混悬剂，这些可能在使用前制备，例如含有单 独的或与载体例如甘露醇一起的活性物质的冻干制剂。药物物质可以是已 灭菌的和/或含有赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增 溶剂、调节渗透压的盐，和/或緩沖剂。本发明的药物组合物如果需要可含
有其它药理学活性物质，如其它c-Kit抑制剂或VEGF受体或c-Scr活性 抑制剂，其通过本身已知的方法、例如通过常规的混合、制粒、包衣、溶 解或冻干方法制备，并含有约1%至100%、特别是约1%至约20%的一种 或多种活性物质。
实施例
以下实施例用于阐述本发明，但不以任何方式限制其范围。 缩略语
DMF N，N-二甲基甲酰胺
h 小时
min 分钟
m.p. 熔,泉
RT 室温
THF 四氢吹喃
实施例1: 4-IY4-曱基-l-艰噢基)-曱基l-N44-羟甲基-3-f4-(3-吡战V2-嘧啶 基卜氨基l-苯基i-苯甲酰胺
在20分钟内，将丙膦酸酐的N，N-二甲基甲酰胺溶液(Fluka， Buchs，瑞 士； 350fil， 50%, 0.6mmol)逐份加入搅拌的N-(5-氨基画2-羟曱基-苯基)-4-(3-p比^^)-2-嗜P雄(117mg， 0.4mmo1)、 4-[(4-甲基-l-艰溱基)-甲基l-苯甲酸二盐酸盐(123mg， 0.4mmol)和三乙胺(445jd， 3.2mmol)于干燥N,N-二甲基曱酰 胺(5ml)中的混合物中。将混合物在RT下搅拌24小时。在减压下蒸除溶 剂，将残余物用饱和碳酸氬钠水溶液(20ml)处理，并用乙酸乙酯(2x20ml) 萃取。将合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液(15ml)洗涤、干燥(MgS04)、 过滤并在减压下蒸除溶剂，得到的粗产物用反相高压液相色谱法(Nagel Polygoprep C18， 7nm， 300A; Macherey-Nagel， Dtiren,德国)纯化，洗脱剂为 0.1%三氟乙酸的水溶液-0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。将含纯产物的级分合 并、用饱和碳酸氢钠水溶液碱化并在减压下蒸发至干。将残余物用饱和碳 酸氢钠水溶液处理并用乙酸乙酯(5x)萃取。将合并的萃取液用水洗涤、干
燥(MgS04)、过滤并在减压下蒸除溶剂，得到的产物用甲醇-乙酸乙酯重结 晶，得到标题化合物，为浅黄色结晶性固体，m.p. 196-198°C。 H-NMR(500MHz， DMSO-d6， 3): 2.14(s， 3H), 2.25-2.45(m, 8H), 3.52 (s， 2H)， 4.56(s， 2H)， 5.50(br.s， 1H)， 7.29(d， J=8.3Hz， 1H)， 7.41(dd， J=2.0， 8.3Hz， 1H), 7.44(d， J=8.1Hz， 2H), 7.50(d， J=5.1Hz， 1H)， 7.52(dd， J=3.3， 8.1Hz, 1H)， 7.93(d， J=8.1Hz， 2H)， 8.56(d, J=2.0Hz， IH)， 8.57(d, J=5.1Hz， 1H)， 8.59(ddd, J=1.4， 2.1, 8.1Hz， 1H), 8.69(dd， J=1.4， 3.3Hz， IH)， 9'10(s， 1H), 9.33(d， J=2.1Hz， 1H)和10.22(s， IH)。
步骤l.l: 2-氨基-4-硝基苯曱醇
将在20。C下搅拌的2-氨基-4-硝基苯甲酸(Aldrich; 18.2g， 100mmol)于 干燥THF(500ml)中的溶液用硼烷-THF复合物(BHs THF; Fluka; lOOml， l.OM)处理，在45分钟内滴加，以调节气体逸出。然后将混合物在65'C下 加热2小时。然后将搅拌的混合物冷却至0r:、用水(20ml)处理并温热至 RT。气体逸出停止后，立即加入盐酸(20ml， 12M),然后将混合物在65°C 下加热30分钟。之后在减压下经旋转蒸发将冷却的混合物浓缩至体积为约 150ml以得到悬液。过滤悬液并将沉淀重新溶解在乙酸乙酯(500ml)中，并 用饱和碳酸氩钠水溶液(2xl50ml)洗涂。将溶液干燥(Na2S04)、过滤并在 减压下蒸除溶剂，得到的粗产物通过用乙酸乙酯-己烷重结晶进行纯化，得到标题化合物，为黄色结晶性固体，m.p. 126-128 °C。
步骤1.2: 2-『(2-丙烯基氧基)-甲基l-5-硝基苯胺
将氩气氛、O'C下搅拌的2-氨基-4-硝基苯甲醇(14.3§， 85mmol)于干 THF(350ml)中的溶液在35分钟内滴加叔丁醇钾的THF溶液(Fluka; 85ml， l.OM)进行处理。将混合物在0'C下搅拌15分钟，然后在0'C下于50分钟 内滴加烯丙基溴(7.9ml， 94mmol)于干燥THF(80ml)中的溶液进行处理，之 后在20'C下搅拌卯分钟。将混合物用乙酸乙酯(800ml)稀释。将得到的溶 液用饱和氯化铵水溶液(3 x400ml)洗涤、干燥(MgS04)、过滤并在减压下 蒸除溶剂，得到的粗产物用硅胶柱色i普法纯化，洗脱剂为50%乙酸乙酯的 己烷溶液，得到标题化合物，为褐色油。
1H-NMR(500MHz, DMSO-d6， S): 4'06(d， J=5.3Hz， 2H); 4.47(s， 2H); 5.22和 5.34(dd， J=10.4， 17,3Hz, 2H); 5.65(br.s， 2H); 5.98(m， J=5,3， 10.4, 17.3Hz， 1H); 7.35(d, J=8.3Hz， 1H); 7.38(dd， J=2.0， 8.3Hz， 1H)和7.52(d， J=2.0Hz，m)。
步骤1.3: {2-(2-丙烯基氧基)-甲基1-5-硝基苯基}-胍
在20。C下，将硝酸(1.04ml， 65%， 15mmol)加入搅拌的2-[(2-丙烯基氧 基)-甲基-5-硝基苯胺(3.15g， 15mmol)的乙醇(30ml)溶液中。然后在95°C下， 于60分钟内向搅拌的混合物中滴加氨腈(0.95g， 22.5mmol)于水(lml)中的 溶液。将混合物在95"C下加热14小时，在这期间加入另外的氨腈等分试 样(共计2,2g， 58mmol)并通过加入贿酸(65。/。)阶段性地将pH调为3。将得 到的溶液冷却至0。C、用氨7jc(5ml， 25%)碱化、用7jc(i50ml)稀释并用乙酸 乙酯(3 x 100ml)萃取。将合并的萃取掖用饱和氯化铵水溶液(50ml)洗涤、 千燥(MgS04)、过滤并在减压下蒸除溶剂，得到标题化合物，为褐色油， 其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤1.4: N-。-『(2-丙烯基氣基)-甲基l-5-硝基-苯基i-4-(3-吡^)-2-嘧咬胺将搅拌的(2-[(2-丙烯基氧基)-甲基j-5-硝基-苯基卜胍(3.75g, 15mmol)、 3國(二甲基氨基)-l-(3-吡啶基)-2-丙烯-l-酮(2.60g, 15mmol)和乙基二异丙基 胺(2.6ml， 15mmol)于l-丁醇(50ml)中的混合物在120。C下加热20小时。然 后在减压下蒸除溶剂，将得到的残余物溶于乙酸乙酯(100ml)。将得到的混 合物过滤(硅藻土)、用饱和氯化钠水溶液(50ml)洗涤、干燥(MgS04)、过滤 并在减压下蒸除溶剂，得到的粗产物用硅胶柱色镨法纯化，洗脱剂为乙酸 乙酯，并用乙酸乙酯-己烷重结晶，得到标题化合物，为黄色结晶性固体， m.p. 213-215'C。
，H画NMR(500MHz, DMSO-d6， S): 4.10(d， J=5.3Hz， 2H)， 4.77(s， 2H)， 5.22和 5.35(dd， J=10.4， 17.3Hz， 2H)， 5.96(m， J=5.3， 10.4， 17.3Hz， 1H)， 7.58(dd， J=4.8， 7.9Hz， 1H)， 7.66(d, J=8.4Hz， 1H), 7.69(d， J=5.2Hz, 1H)， 7.95(ddd， J=1.2， 1.2， 7.9Hz， 1H)， 8.51(dd， J=1.6， 8.4Hz， 1H)， 8.67(d， J=5.2Hz， 1H)， 8.73(dd， J=1.2, 4.8Hz, 1H)， 9.05(d， J=1.2Hz， 1H)， 9.23(br.s， 1H)和9.35(d, J=1.6Hz， 1H)。
歩骤1.5: N-(2-羟曱基-5-硝基-苯基)-4-(3-吡^)-2-嗜咬胺
将聚曱基氢硅氧烷(860mg)、四(三苯基膦)钯(70mg)和氯化锌(2.66ml， 0.5M的THF溶液，1.33mmol)加入搅拌的N-口-[(2-丙烯基氧基)-甲基卜5-硝 基國苯基卜4-(3-吡鈔0-2-嘧咬胺(2.60g， 7.2mmol)于干燥THF(60ml)中的溶 液中。然后将混合物在3(TC、氩气氛下搅拌30小时。然后在减压下蒸除 溶剂，将得到的残余物用饱和氯化钠水溶液(50ml)处理并用乙酸乙酯(3 x 50ml)萃取。将合并的萃取液干燥(Na2S04)、过滤并在减压下蒸除溶剂，得 到的粗产物用THF重结晶，得到标题化合物，为浅黄色结晶性固体，m.p. 247-250 C。
歩骤1.6: N-(5-氨基-2-羟甲基-苯基)-4-(3-吡咬基)-2-嘧咬胺
在25°C、大气压力下，将^(2-羟甲基-5-硝基-苯基)-4-(3-吡!^)-2-嘧"她(0,23g， 0.71mmol)于乙醇(230ml)中的溶液用阮内镍(0.2g)氩化。在13 小时内吸收计算量的氢。然后将混合物过滤并在减压下蒸除'溶剂，得到的并IL产物用珪胶柱色镨法纯化，洗脱剂为25%氨水-乙醇-二氯甲烷(1:9:卯)， 得到标题化合物，为黄色结晶性固体，m.p. 213-215'C。 ，H-NMR(500MHz， DMSO-d6, S): 4'42(d， J=5.1Hz， 2H)， 5.05(br.s， 2H), 5.26 (t， J=5.1Hz， 1H)， 6.23(dd， J=2.1， 8.0Hz， 1H)， 6.91(d， J=8.0Hz， 1H)， 7.35(d， J=2.0Hz， 1H)， 7.45(d， J=5.1Hz， 1H)， 7.56(dd, J=4.7, 8.0Hz， 1H)， 8.47(ddd， J=1.8， 1.8， 8.0Hz， 1H)， 8.53(d， J=5.1Hz， 1H)， 8.70(dd， J=1.4， 4.7Hz， 1H)， 8.88(s， 1H)和9J9(d， J=2.4Hz， 1H)。
实施例2: 4-『"-曱基-4-氧化-l-哌唤基)-甲基l-N"4-曱基-3-〖4-(3-吡狄)-2-嘧咬基1-氨基1-苯基V苯曱酰胺
在-20。C下，将3-氯过氧苯甲酸(Fluka， Buchs，瑞士； 2.06g， 55%， 4.27mmol)加入搅拌的4-[(4-甲基-l-哌溱基)-甲基-N-(4-甲基-3-[[4-(3-吡啶 基)-2-嘧咬基-氨基-苯基卜苯甲酰胺(如EP 0564409B1实施例21所述制备， 2.00g， 4.05mmo1)于二氯甲烷(70ml)中的混合物中。然后将得到的混合物在 RT下搅拌72小时。之后在减压下蒸除溶剂，得到的混合物用硅胶柱色语 法纯化，洗脱剂为二氯曱烷-甲醇-水(70:30:5)，得到标题化合物，为黄色结 晶性固体，m.p. 154-158。C。
实施例3: 4画(4-甲基-1-哌噢基)陽甲基1國]\-4-曱基誦3-4-(1-氧化-3-吡^)-2-嘧啶基l-氨基卜苯基l-苯曱酰胺
将N-甲基哌嗪(99mg， l.Ommol)加入搅拌的4-氯甲基-N-[4-甲基 _3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基j-氨基l-苯基卜苯甲酰胺(220mg， 0.49mmol)于乙醇(5ml)中的悬液中。然后将混合物在IOO"C下搅拌15小时 以得到溶液，之后将其冷却至RT并用乙酸乙酯(200ml)处理。将得到的溶 液用氢氧化钠水溶液(100ml， 2M)和饱和氯化钠水溶液(100ml)洗涤、干燥 (Na2S04)、过滤并在减压下蒸除溶剂，得到的粗产物用硅胶柱色镨法纯化， 洗脱剂为25%氨水-甲醇-二氯甲烷(0.5:10:90),得到标题化合物，为黄色结 晶性固体，m.p. 232-235。C。
38歩骤3.1: N-4-甲基-3-『『4-(l-氧化-3-吡纽)-2-嘧絲l-氨基l-苯基l-苯曱酰
整
利用实施例2中所述的方法，但用N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡^&)-2-嘧啶 基-氨基卜苯基-苯甲酰胺(如EP 0564409B1实施例20所述制备)代替4-[(4-曱基-l-哌嗪基)-曱基-]\-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基-氨基卜苯基}-苯甲酰胺，得到的标题化合物用硅胶柱色镨法纯化，洗脱剂为10%甲醇的 二氯甲烷溶液，并用乙醇重结晶，得到标题化合物，为浅黄色结晶性固体， m.p. 258-260 "C。
步骤3.2: 4-曱基-N-344-(l-氧化-3-吡咬基)-2-嘧咬基l-l,3-苯二胺
将盐酸(9ml， 4M)加入N-[4-甲基-3-[[4-(l-氧化-3-吡^J0-2-嘧^J^-氨 基-苯基I-苯曱酰胺(0.43g, 1.08mmol)于正丙醇(9ml)中的悬液中，并将得到 的混合物在100。C下加热34小时。在减压下蒸发冷却后的混合物，得到油， 将其溶于水(10ml)、过滤并用氢氧化钠水溶液(4M)碱化。将生成的沉淀过 滤、用水洗涤并干燥，得到的粗产物用乙醇重结晶，得到标题化合物，为 黄色结晶性固体，m.p. 104-106'C。
歩骤3.3: 4-氯甲基-N-『4-甲基-3-『4-(l-氧化-3-吡鈔0-2-嘧咬基l-氨基l-苯 基l-苯曱酰胺
将4-(氯甲基)-苯甲酰氯(Fluka，Buchs，瑞士； 184mg， 0.977mmol)于二 、懲烷(2ml)中的溶液滴加至4-甲基-^3-[4-(1-氧化-3-吡^^)-2-嘧咬基-1，3-笨二胺(275mg, 0.937mmol)于二噍烷(5ml)中的溶液中，并将混合物在20 匸下搅拌75分钟。然后加入第二份溶于二哺、烷(lml)的4-(氯甲基)-苯甲酰 氯(60mg，0.317mmo1)，并将混合物继续搅拌120分钟。将得到的悬液用乙 酸乙酯(50ml)处理，用氢氧化钠水溶液(2x50ml， 2M)洗涤得到的溶液。将 乙酸乙酯溶液干燥(Na2S04)、过滤并在减压下蒸除溶剂，得到的粗产物用 硅胶柱色镨法纯化，洗脱剂为5%曱醇的二氯甲烷溶液，得到标题化合物， 为黄色结晶性固体，m.p. 224-226"C。实施例4: 4-『(4-曱基-l,4-二氧化-l-哌唤基)-曱基l-N-M-甲基-3-4"3-吡啶 基)-2-嘧咬基1-氨基1-笨基}-苯甲酰胺
将4-[(4-甲基-l-哌溱基)-甲基-N-(4-甲基-3-[[4-(3-吡咬基)-2-嘧啶基-氨基-苯基卜苯甲酰胺单甲磺酸盐(3.00g， 5mmol;如WO 99/03854所述制 备)加入过氧化氢水溶液(30ml， 3%)中，并将得到的溶液在20X:下搅拌160 小时。然后用氢氧化钠水溶液(4M)调节溶液pH至14，并将得到的悬液搅 拌1.5小时。将粗产物滤出、用水洗涤、干燥并用硅胶柱色镨法纯化，洗 脱剂为25%氨7^-乙醇-二氯甲烷(5:30:70),得到标题化合物，为黄色结晶 性固体，m.p. 242-244。C。
实施例5: 4-(4-甲基-l-哌唤基)-甲基l-N-M-羟甲基-3-『4"3-吡^)-2-嘧啶 基l-氨基l-苯基卜苯甲酰胺
在20分钟内，将丙膦酸酐的N,N-二甲基甲酰胺溶液(Fluka， Buchs，瑞 士； 350jil， 50%, 0.6mmol)逐份加入搅拌的实施例1步骤1.6中所述的 N-[2誦[5國氨基國(2画羟基)甲基苯基-4画(3-吡"^)匪2-嘧咬胺(117mg， 0.4mmo1)、 4-[(4-曱基-l-哌溱基)甲基]苯甲酸二盐酸盐(123mg， 0.4mmo1)和三乙胺 (445fil， 3.2mmol)于千燥N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的混合物中。将混合物 在室温下搅拌24小时。减压下蒸除溶剂，将残余物用饱和碳酸氢钠水溶液 (20ml)处理并用乙酸乙酯(2 x 20ml)萃取。将合并的萃取液用饱和氯化钠水 溶液(15ml)洗涤、干燥(MgS04)、过滤并在减压下蒸除溶剂，得到的粗产 物用反相高压液相色镨法(Nagel Polygoprep C18， 7nm， 300A; Macherey-Nagel， Dttren，德国)纯化，洗脱剂为0.1°/。三氟甲酸的水溶液 -0.1%三氟甲酸的乙腈溶液。将含纯产物的级分合并、用饱和碳酸氬钠水 溶液碱化并在减压下蒸发至干。将残余物用饱和碳酸氲钠水溶液处理并用 乙酸乙酯(5x)萃取。合并的萃取液用水洗涤、干燥(MgS04)、过滤并在减 压下蒸除溶剂，得到的产物用甲醇-乙酸乙酯重结晶，得到标题化合物，为 浅黄色结晶性固体，m.p. 196-198"C。
，H-匪R(500MHz， DMSO-d6， S): 2.14(s， 3H)， 2.25-2.45(m， 8H), 3.52(s， 2H),4'56(s， 2H)， 5.50(br.s， 1H)， 7.29(d， J=8.3Hz, 1H)， 7.41(dd， J=2.0， 8.3Hz， 1H)， 7.44(d， J=8.1Hz， 2H)， 7.50(d， J=5.1Hz， 1H)， 7.52(dd， J=3.3， 8.1Hz, 1H)， 7.93(d， J=8.1Hz， 2H)， 8.56(d， J=2.0Hz， 1H)， 8'57(d， J=5.1Hz， 1H)， 8.59(ddd, J=1.4， 2.1， 8.1Hz， IH)， 8.69(dd， J=1.4， 3.3Hz， IH)， 9'10(s， IH)， 9.33(d， J=2.1Hz, 1H)和10.22(s， IH)。
实施例6: 4-f(3-氣代-l-哌噢基)-甲基l-N"4-曱基-3-〖4-(3-吡^J0-2-嘧喷二基l 氨基l苯基i苯甲酰胺
将丙膦酸酐的N，N-二甲基甲酰胺溶液(Fluka， Buchs，瑞士； 1.3ml， 50%, 2.25mmol)滴加至搅拌的4-甲基-N-[4-(3-吡^J+2-嘧^^&-l，3-苯二 胺(416mg, 1.5mmol)、 4誦[(3國氧代-l國派溱基)甲基苯甲酸(351mg， 1.5mmol) 和三乙胺(1.7ml， 12mmol)于干燥N，N-二甲基曱酰胺(4ml)中的混合物中。将 混合物在室温下搅拌17小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)处理。 将形成的沉淀过滤、用水洗涤、干燥并用甲醇重结晶，得到标题化合物， 为膏状结晶性固体。
H-NMR(500MHz， DMSO-d6， 3)卯m 2.21(s， 3H), 2.63(t， J=5.49Hz， 2H)， 2.別(s, 3H)， 2.96(s， 2H)， 3.26(t， J=5.42Hz， 2H)， 3.60(s， 2H)， 7.19(d， J=8.39Hz， 1H)， 7'42(d， J=5.19Hz， 1H), 7.46(m， 3H)， 7.51(dd， J=7.93, 4.73Hz, 1H)， 7.91(d, J=8.09Hz， 1H)， 8.06(s， 1H)， 8.47(m， IH)， 8.50(d， J=5,04Hz， 1H), 8.67(dd， J=4.73， 1.53Hz， IH)， 8'99(s， 1H), 9.26(d, J=1.98Hz, IH)和10.18(s， IH)。
4- r(3-氧代-i -p底溱基)甲基i苯甲酸
将3-溴甲基苯甲酸(4,30g， 20mmol)、腺唤-2-酮(2.0g， 20mmol)和粉状的 碳酸钾(2.76g, 20mmol)于甲醇(50ml)中的混合物在室温下搅拌17小时。将 得到的混合物过滤并在减压下蒸除溶剂，得到的残余物用盐酸(80ml， 0.25M)处理并搅拌5分钟。将沉淀的产物过滤、用水洗涤、干燥并用甲醇 重结晶，得到标题化合物，为膏状结晶性固体。实施例7: 4醒『(4國曱基隱3國氧代-1-哌臻基)甲基1画^『4腸曱基國3-『『4-(3-吡战)-2-嘧咬基l氨基l苯基l苯甲酰胺
利用实施例6中所述的方法，但用4-[(4-甲基-3-氧代-l-哌溱基)甲基
苯曱酸代替4-[(3-氧代-l-哌溱基)甲基l苯甲酸，得到标题化合物，为黄色结 晶性固体，m.p. 187-192。C。
H國NMR(500MHz， DMSO-d6， 3) 2.21(s， 3H)， 2.55(t， J=5.34Hz， 2H), 2.91(s， 2H)， 3.15(m， 2H)， 3.61(s， 2H)， 7.19(d， J=8.24Hz， 1H), 7.42(d, J=5.19Hz, 1H), 7.46(t， J=8.01Hz, 1H), 7.48(m， 2H), 7.51(dd， J=7.86, 4.81Hz， 1H), 7.77(s， 1H)， 7.91(d， J=8.09Hz， 2H)， 8.07(s， 1H)， 8.47(d， J=7.94Hz， 1H)， 8.50(d， J=5.19Hz， 1H)， 8.67(d, J=3.36Hz， 1H)， 8.99(s， 1H), 9.27(s， 1H)和10.18(s， 1H)。
4-(4-甲基-3-氧代-l -哌唤基)甲基l苯甲酸
利用4-[(3-氧代-l-哌嚷基)甲基l苯甲酸项下所述的方法，但用1-甲基 哌溱-2-酮代替p底溱-2-酮，得到标题化合物，为膏状结晶性固体。
实施例8:
通常以如下组成制备含100mg式II化合物、例如实施例1-4中所述的 式II化合物之一的片剂
组成
活性成分 100 mg
结晶乳糖 240 mg
Avicel 80 mg
PVPPXL 20 mg
Aerosil 2 mg
硬月旨酸镇 5 mg
447 mg制备:将活性成分与载体物质混合并在压片机(KorschEKO，冲直径10mm)
上压制。
Avicel是微晶纤维素(FMC，费城，美国)。 PVPPXL是交联聚乙烯聚吡咯烷酮(BASF，德国)。 Aerosil是二氧化珪(Degussa，德国)。
实施例9:
通常以如下组成制备含100mg式II化合物、例如实施例1-4中所述的 式II化合物之一的胶嚢剂
组成
活性成分 100 mg
Avicel 200 mg
PVPPXL 15 mg
Aerosil 2 mg
硬月曽酸镁 1.5 mg
318.5mg
制备:通过将各成分混合并将混合物填充至1号硬明胶胶嚢中制备胶嚢剂。
权利要求
1. 式I的化合物其中R1为氢或羟基，R2为氢、低级烷基或羟基-低级烷基，A为-NR5R6、-CR5R6或-OR5R6，R5R6一起为含有四个、五个或六个碳原子的亚烷基、含有一个氧原子和三个或四个碳原子的氧杂-低级亚烷基，或含一个或两个氮原子和两个、三个或四个碳原子的氮杂-低级亚烷基，其中的氮原子是未取代的或被低级烷基、羟基-低级烷基或乙酰基取代，且其中每种情况下的低级亚烷基可以是部分或完全不饱和的和/或当低级亚烷基不是完全不饱和时，低级亚烷基的碳原子可被低级烷基、羟基、低级烷氧基或氧代基取代，且其中至少一个氮原子带有氧原子以形成相应的N-氧化物，或当没有氮原子带有氧原子时，A被氧代基取代，或所述化合物的可药用盐。
2.根据权利要求1的式I化合物，其中A为吡咯烷子基、哌咬基、 哌啶子基、哌溱基、p比一咬基、吡洛烷子基、吡咯烷基、吗啉代、低级烷基 哌溱子基、N-甲基哌唤子基、4-曱基-3-氧代-l-哌瘵基、3-氧代-l-哌溱基、 1H-咪唑基、1H-2-甲基咪哇基、1H-4-甲基咪哇基、lH-2，4-二甲基咪唑基、环己基或苯基，任选地在环碳上被氧代基取代， 或所述化合物的可药用盐。
3.根据权利要求l的式I化合物，其中A为下式A，的P底溱基:任选地在环碳上被氧代基取代，且R3为氩、低级烷基或乙酰基， 或所述化合物的可药用盐。
4. 根据权利要求3的式I化合物，其中 R为氢，R2为氢、甲基或羟甲基，R3为甲基或氢，或所述化合物的可药用盐。
5. 根据权利要求1的式I化合物，其为4-[(3-氧代-l-P底溱基)甲基l-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡咬基)-2-嘧咬基氨基苯基]苯曱酰胺，或其可药用盐。
6. 根据权利要求1的式I化合物，其为4-[(4-甲基-3-氧代-l-哌溱基) 甲基卜N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡錄)-2-嘧纽]氨基I苯基苯甲酰胺，或其可药 用盐。
7. 式II的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>其中:R为氢或羟基，R2为低级烷基或羟基-低级烷基， R3为氢、甲基或乙酰基，且星号指示任选地带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子， 条件是如果R为氢、R2为曱基且R3为氢或甲基，则用星号标记的三个氮原子中的至少一个带有氧原子，或其盐。
8. 根据权利要求7的式II化合物，其中 R,为氢，R2为甲基或羟甲基， R3为甲基，且星号指示任选地带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子， 条件是如果R2为甲基，则用星号标记的三个氮原子中的至少一个带有氧原子，或其盐。
9. 根据权利要求7的式II化合物，其中R2为羟基-低级烷基， R3为甲基，且星号指示任选地带有氧原子以形成相应N-氧化物的氮原子， 或其盐。
10. 根据权利要求7的式II化合物，其为4-[(4-曱基-4-氧化-1-"底溱基)-甲基-!^{4-曱基-3-[[4-(3-吡^&)-2-嘧^-氨基-苯基}-苯甲酰胺，或其可药用的盐。
11. 根据权利要求8的式II化合物，其为4-[(4-甲基-1-p底噪基)-甲 基]-N-[4-甲基-3-[[4-(l-氧化-3-吡纽)-2-嘧組-氨基-苯基-苯甲酰胺，或其可药用的盐。
12. 根据权利要求8的式II化合物，其为4-[(4-甲基-l，4-二氧化-l-派嗪基)-甲基卜N-H-甲基-3-[[4-(3-吡狄)-2-嘧錄I-絲-苯基卜苯甲酰胺， 或其可药用的盐。
13. 根据权利要求8或9的式II化合物，其为4-[(4-甲基-1-哌溱基)-甲基卜N-《4-羟甲基-3-[[4-(3-吡^)-2-嘧咬基卜氨基-苯基}-苯甲酰胺，或其可药用的盐。
14. 权利要求1至13中任一项的化合物或其可药用盐，用于治疗性治 疗包括人在内的温血动物的方法中。
15. 包含权利要求1至13中任一项的化合物或其可药用盐以及可药用 载体的药物组合物。
16. 用于治疗包括人在内的温血动物的增殖性疾病的药物组合物，其 包含权利要求1至13中任一项的化合物或所述化合物的可药用盐作为活性 成分以及可药用的载体。
17. 权利要求1至13中任一项的化合物或所述化合物的可药用盐在制 备用于治疗增殖性疾病的药物组合物中的用途。
18. 权利要求1至13中任一项的化合物或所述化合物的可药用盐在治 疗增殖性疾病中的用途。
19. 治疗包括人在内的温血动物的方法，其包括向所述的患有增殖性 疾病的温血动物以有效对抗所述疾病的剂量施用权利要求1至13中任一项 的化合物或所述化合物的可药用盐。
20. 制备权利要求7的式II化合物或其盐的方法，其特征在于使式 II化合物 A其中R和R2具有权利要求1的式I化合物所定义的含义，且星号指示任 选地带有氧原子的氮原子，与式III化合物反应，<formula>formula see original document page 6</formula>其中R3具有权利要求1的式I化合物所定义的含义，且星号指示任选地带有氧原子的氮原子；并任选地将由此获得的化合物用适宜的氧化剂转化为式I的N-氧化物；其中存在于式II和III化合物中且不应参与反应的官能团必要时以被 保护的形式存在，并将存在的保护基裂解，其中式II和III化合物也可以 以盐的形式存在，条件是存在成盐基团且盐形式的反应是可能的；并且如果需要，将由此获得的式I化合物转化为另一种式I化合物， 将所得的游离式I化合物转化为盐，将所得的式I化合物的盐转化为游离 化合物或另 一种盐，和/或将式I的异构体化合物的混合物分离为单独的异构体o
全文摘要
本发明涉及其中至少一个氮原子带有氧原子以形成N-氧化物的式(I)的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，其制备方法、包含这些化合物的药物组合物，以及其在制备用于治疗性治疗包括人在内的温血动物的药物组合物中的用途。
文档编号A61P43/00GK101468984SQ20091000266
公开日2009年7月1日 申请日期2003年1月22日 优先权日2002年1月23日
发明者G·格罗斯, J·齐默尔曼, K·O·伯恩森, P·W·曼利, P·恩德, U·普法尔 申请人:诺瓦提斯公司