专利名称：一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及 其应用。
背景技术：
肝细胞癌(h印atocellular carcinoma,HCC)是一种常见的、致死率极高的恶性肿 瘤，每年约650， 000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。该病多发于东南亚和非洲，其 中约有50%以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的第二位。HCC早期诊断较难，病情进展 快，预后水平低。手术切除一直被认为是HCC获得根治的最佳手段，但是仅有10-20%的病 人适合通过手术来干预；除此之外，即使是根治性切除，5年内仍有60_70%的病人会出现 转移复发而危及生命，而局部治疗的转移复发率则更高。HCC的转移是影响治疗效果和预后 的最大障碍，是导致其高死亡率的主要原因。 近年来，针对HCC的转移进行了大量研究并找到了许多重要的分子，如黏附分 子、细胞骨架及调节蛋白、基质降解酶、癌基因及抑癌基因、血管生成的调控因子、肿瘤免疫 相关分子等。也即HCC的转移过程与肿瘤细胞的黏附运动、细胞增殖、细胞外基质、机体免 疫、肿瘤血管生成等多因素有关。尽管对HCC转移进行了大量研究，但目前HCC转移的分子 机制仍不明确，尚未发现预测HCC复发转移的分子标志物和有效的治疗靶标。
Rab27B是Rab家族中Rab27亚族成员，Rab家族在细胞内发挥着非常广泛的生物 学功能，包括细胞的分泌、胞吞、信号转导及发育。Rab GTPase是机体内一组与内膜运输相 关的调节蛋白。Rab家族在肿瘤的生长和转移过程中发挥了重要的作用，如Rab20在胰腺 癌中高表达，在肿瘤的生长过程中发挥了重要的作用；Rab23和Rab5a在肝细胞癌中高表 达，在HCC的生长和增殖过程中，发挥了重要的作用，其中Rab5a在EGF信号通路中起了重 要作用；Rab25介导的信号通路在卵巢癌的细胞增殖和凋亡的调控中发挥了重要的作用； Rab25可以通过指引整合素循环囊泡的定位以及增强肿瘤细胞侵袭胞外基质的能力来加速 肿瘤的生长。 Rab27亚族包括两个成员:Rab27A和Rab27B。 Rab27A与Griscelli Disease有 关，在溶酶体样细胞器中起了重要的作用。研究发现Rab27A和Rab27B在序列和结构上有 高度的保守性。两者在功能上也有一定的相似性。乳腺癌中Rab27a的过表达，增强了肿瘤 的侵袭能力和转移潜能，与胰岛素样生长因子2的分泌相关。目前为止尚未见到其与肿瘤 的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小干扰RNA。 本发明提供的小干扰RNA是序列表中序列4和5所示的核苷酸序列组成的双链 RNA。 编码上述的小干扰RNA的DNA片段也属于本发明的保护范围之内。
上述的DNA片段，如式I所示
SEQ正向-X-SEQ反向
(I) 其中，SEQ^的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
SEQ反^与所述SEQ^反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向或者X与SEQ反向均不互补。 上述X是内含子，所述内含子的核苷酸序列如序列表中序列3所示。 含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。 上述重组载体是将上述的DNA片段插入GCSilenCerTMU6/Neo/GFP载体的多克隆位
点构建成的重组表达载体。 上述小干扰RNA、上述DNA片段或者上述的重组载体在制备抑制Rab27B基因表达 产品中的应用也属于本发明的保护范围之内。
上述Rab27B基因是如下1)或2): 1)核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第112-768位所示；
2)核苷酸序列如序列表中序列1所示。 上述小干扰RNA、上述DNA片段或者上述的重组载体在制备治疗肝细胞癌细胞转 移的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。 上述小干扰RNA、上述DNA片段或者上述的重组载体在制备肝细胞癌细胞转移的
药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。 上述肝细胞癌细胞具体可为HCC97H。 实验证明本发明提供的DNA片段导入肝细胞癌细胞中，Rab27B蛋白表达量显著 下调，并且敲低Rab27B后，HCC97H细胞体外增殖能力、体外黏附能力、体外迁移能力和体外 侵袭能力都显著下降。
图1半定量RT-PCR检测三株细胞中Rab27B mRNA水平的差异。 图2Western blot检测三株细胞中Rab27B蛋白水平的差异。 图3Rab27B在HCC97H细胞中的荧光定位(400X)。 图4Western blot检测shRab27B质粒载体敲低效果。 图5敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外增殖能力的影响。 图6敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外黏附能力的影响。 图7敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(划痕愈合模型)。 图8敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(Transwell)。 图9敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外侵袭能力的影响(Transwell)。 其中图4-图9中的HCC97H是指HCC97H组细胞的实验结果，Mock是指阴性对照
(也即是指将一段不发挥作用的DNA片段(核苷酸序列是GGCAGATAAAGCACTAGCATTCAAGAGA
TGCTAGTGCTTTATCTGCC)转染HCC97H细胞得到的重组细胞)的结果，shRab27B是
97H-shRab27B组细胞实验结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例1、比较不同转移能力肝细胞癌细胞株中Rab27B的mRNA和蛋白表达水平，
及Rab27B的细胞内定位 1、收集细胞，提取RNA和蛋白质 肝细胞癌细胞株HCC97L、HCC97H和HCCLM6购自复旦大学肝癌研究所，其转移能力 依次增强，将三株细胞在37°C、5% C02下培养于添加10%胎牛血清(FBS，澳大利亚PAA公 司)的DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)中，待细胞生长至80%汇合度时，收集细胞。
提取三株细胞的总RNA，反转录合成其cDNA。用细胞裂解液(20mM Tris[pH7. 5]， 150mM NaCl， lmM EDTA， lmM PMSF，O. 1% SDS， 1% NP_40，0. 5%去氧胆酸钠)裂解所收集的 细胞，然后用4t:离心机10000g离心15min，收集裂解液上清，即为细胞总蛋白。
2、半定量RT-PCR和Western blot检测Rab27B含量的变化(图1和图2)
将步骤1中所合成的cDNA为模板，在引物Rab27B-F(上游引物) 5， -ATGACCGATGGAGACTATGATTATC-3，禾P Rab27B-R(下游弓|物)5， -CTAGCAGATACATTT CTTCTCTGGTGTG-3'的引导下，PCR扩增三株细胞中Rab27B蛋白的基因(657bp)，同时 以GAPDH(452bp)为内参对照，上下游引物分别为5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，和 5' -TCCACCACCCTGTTGCT GTA-3'。将PCR产物进行1 %琼脂糖电泳，结果如图1所示，随着 转移能力的增强，Rab27B的mRNA水平在三株细胞中逐渐增高，说明Rab27B可能参与了 HCC 的转移过程。 将细胞总蛋白在IO(TC下煮10min后进行12% SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移至 硝酸纤维素膜上，然后分别用Rab27B的多克隆抗体(Santa Cruz公司)和beta-actin单 克隆抗体(Proteintech公司)进行Western blot检测，结果如图2所示，在三株细胞中 Rab27B的含量依次增高，表明Rab27B与HCC的转移相关。
3、 Rab27B的细胞内定位(图3) 将已消毒的18mm盖玻片置于六孔培养板中，按IX 105/ml的细胞密度将HCC97H 细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，第二天后进行免疫荧光染色鉴定；4%多聚甲醛固定 10min ;封闭血清孵育(5%正常二抗血清PBS液)30min ;—抗孵育(Rab27B羊多抗，Santa Cruz公司，PBS配，滴度1 : 100) 37°C 2h，阴性对照为羊血清，空白对照用PBS液；PBS清洗 标本3次各5min ;滴加1 : 1000FITC标记的兔抗羊二抗，室温孵育30min，PBS洗涤三遍以 后，滴加染核试剂Hochest(PBS 1 : 5000稀释)，室温孵育30min，PBS洗涤三遍以后，80X 甘油封片、镜检、拍照。结果如图3所示，Rab27B主要分布于细胞的胞质中，这与其相应的 参与细胞的分泌及运输功能相一致。 实施例2、稳定敲低Rab27B的细胞株的构建及其表型检测
—、稳定敲低Rab27B的细胞株的构建
1、重组表达载体的构建
1)化学合成片段ABC 片段ABC是片段A、片段B和片段C依次连接而成，其中片段A的核苷酸序列如序 列表中序列2所示，片段B的核苷酸序列如序列表中序列3所示，片段C的核苷酸序列与片段A反向互补。在片段ABC的两端加上酶切位点EcoR I和BamH I。 2)将片段ABC插入pGCSilenCerTMU6/Ne0/GFP载体(购自上海吉凯基因技术有限 公司，货号20106)的酶切位点EcoR I和BamH I之间，构成重组表达载体pGCsilencerTMU6/ Neo/GFP/RNAi 。
2、转染 将步骤1获得的重组表达载体用LipofectamineTM 2000 (Invitrogen公司)转染 HCC97H细胞(可购自上海中山医院)，再将转染细胞在37°C 、5% C02下培养于添加10% FBS 的DMEM高糖培养基中，然后加入O. 4mg/ml G418进行筛选，待细胞形成克隆后，挑取带有荧 光的单克隆进行培养，从得到稳定敲低Rab27B表达水平的细胞株，命名为97H-shRab27B。
3、敲低效果检测 用细胞裂解液裂解步骤2中所收集的单克隆稳定细胞株，然后用4t:离心机 10000g离心15min，收集裂解液上清，即为细胞总蛋白。将细胞总蛋白在IO(TC下煮10min 后进行12% SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移至硝酸纤维素膜上，然后分别用Rab27B的 多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，货号sc-22993)和beta-actin单克隆抗体(购自 Protein-tech公司，货号60008-1-Ig)进行Western blot检测，结果如图4显示，与阴性对 照mock及正常HCC97H细胞相比，转染后的shRab27B组细胞的Rab27B的表达水平下调约 70%。 二、表型检测
培养基配方 无血清DMEM高糖培养基(购自Hyclone公司) 有血清DMEM高糖培养基(胎牛血清购自PAA公司，含10 %血清)含BSA的DMEM高糖培养基(BSA购自Merck公司，含5 % BSA) 1 、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外贴壁增殖的影响(MTT比色分析)(图
5) 分别取对数生长期(70% _80%汇合度)的HCC97H、97H-shRab27B和mock组细 胞，O. 25%胰酶(Hyclone公司)消化成细胞悬液，以1. 0X 105个/ml接种于96孔细胞培 养板，每孔0. lml， 12h后完全贴壁，经无血清DMEM高糖培养基同步培养24h后，换有血清 DMEM高糖培养基继续培养24h，每组细胞设5个平行复孔实验；每孔加入20 0. 5%噻唑 篮(Sigma公司)(MTT)，继续培养4h ;终止培养，吸出孔内培养液，每孔加入150 二甲基 亚砜(Sigma公司)(匿S0)，置摇床上低速震荡lOmin，使结晶物充分溶解；在酶标仪0D490nm 处测量各孔的吸光值。结果如图5，97H-shRab27B组细胞的体外贴壁增殖能力与HCC97H组 细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B 的表达后HCC97H细胞的增殖能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的增殖过程。
2、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外黏附的影响(平板黏附实验)(图6)
96孔培养板分别均匀包被DMEM高糖培养基(FBS10 % ) 10 iU， 4 °C过夜，超 净工作台风干，紫外线照射消毒；分别取对数生长期(70%-80%汇合度)的HCC97H、 97H-shRab27B和mock细胞，O. 25% trypsin消化成细胞悬液，离心弃上清后，用无血清 DMEM高糖培养基把细胞制成悬液(0. 4X 106个/ml)，各取细胞悬液100 y 1加入培养板中， 每组细胞设3个平行复孔实验，继续常规培养；培养60min后，37°C PBS洗去未黏附的细胞，
6进行MTT比色，测各孔490nm波长光吸收值(A值)，用A值大小表达黏附活细胞数的相对多 少。结果如图6，shRab27B组细胞的黏附能力与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock 组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的黏附能 力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的黏附过程。 3、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(划痕愈合模型)(图 7) 首先用记号笔在六孔培养板后沿直尺划平行线，每条线之间间隔lcm;HCC97H、 97H-shRab27B和mock细胞分别以2X 105个/ml接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬 液，置于培养箱培养；待细胞生长至60-70%汇合度后，用200 iU枪头沿直线做划痕，划痕 与记号笔所画直线垂直，一般做三道，然后用PBS清洗细胞三次，再加入培养基继续培养； 分别在划痕后0h、12h、24h和48h拍照。测量细胞划痕宽度。结果如图7所示，shRab27B 组细胞的划痕愈合速率与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H 组细胞无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的迁移能力显著下降，即Rab27B 参与HCC97H的迁移过程，进而影响了 HCC97H细胞的转移过程。 4、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外迁移能力的影响(Transwell实验) (图8) 制备细胞悬液前先让细胞无血清饥饿24h ;分别取对数生长期(70_80%汇合度) 的HCC97H、97H-shRab27B、 mock三组细胞，消化后，离心弃去培养基，用PBS(pH = 7. 4)清 洗，用含BSA的无血清DMEM高糖培养基(5%BSA)重悬，调整细胞密度为10X105/ml ;在24 孔板下室加入500 iil含10% FBS的DMEM培养基，用无菌镊将Transwell小室放入有培养 基的孔内，必须确认膜下没有气泡，并避免小室在液体中形成角度。取三组细胞悬液100 i！ 1 加入Transwell小室中，每组细胞设3个平行复孔实验。置于培养箱中常规培养24h ;24h后 从培养箱中取出Transwell小室，用棉签蘸无血清的DMEM培养基擦拭除去Transwell小室 上层的细胞；将Transwell小室置于甲醇中固定10min， PBS清洗5minX3次；将Traswell 小室移入0. 1X结晶紫中，染色30min， PBS清洗5minX3次；取出Transwell小室，底面朝 上，置于光镜下，膜上滴一滴水，上置盖玻片；每个滤膜随即选取5个视野，计数穿膜细胞 数，以穿膜细胞的数目表示细胞的相对侵袭能力。结果如图8所示，97H-shRab27B组细胞 的穿膜细胞数与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞 无显著差异，说明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的迁移能力显著下降，即Rab27B参与 HCC97H的迁移过程，进而影响了 HCC97H细胞的转移过程。 5、稳定敲低Rab27B表达对HCC97H细胞体外侵袭能力的影响(Transwell实验) (图9) 把24孔板Transwell小室置于冰上遇冷，将Matrigel胶(BD公司)(50 ii g/ml) 从-2(TC中取出，置于4t:过夜溶解，把Matrigel胶和无血清DMEM培养基按1 : 3混合， 按每孔20 iU包被Traswell小室底部膜的上室面，4"C风干；制备细胞悬液前先让细胞无 血清饥饿24h ;分别取对数生长期(70-80 %汇合度)的HCC97H、97H-shRab27B、 mock三组 细胞，消化后，离心弃去培养基，用PBS(pH = 7. 4)清洗，用含BSA的无血清DMEM高糖培养 基(5%BSA)重悬，调整细胞密度为10X107ml ;在24孔板下室加入500 yl含10% FBS的 DMEM培养基，用无菌镊将Transwell小室放入有培养基的孔内，必须确认膜下没有气泡，并
7避免小室在液体中形成角度。取三组细胞悬液100 ill加入Transwell小室中，每组细胞设 3个平行复孔实验。置于培养箱中常规培养24h ;24h后从培养箱中取出Transwell小室， 用棉签蘸无血清的DMEM培养基擦拭出去Transwell小室上层的Matrigel胶及其表面的细 胞；将Transwell小室置于甲醇中固定10min，PBS清洗5minX3次；将Traswell小室移入 0. 1%结晶紫中，染色30min， PBS清洗5minX3次；取出Transwell小室，底面朝上，置于光 镜下，膜上滴一滴水，上置盖玻片；每个滤膜随即选取5个视野，计数穿膜细胞数，以穿膜细 胞的数目表示细胞的相对侵袭能力。结果如图9所示，97H-shRab27B组细胞的穿膜细胞数 与HCC97H组细胞相比有显著的下降，而mock组的细胞则与HCC97H组细胞无显著差异，说 明降低Rab27B的表达后HCC97H细胞的侵袭能力显著下降，即Rab27B参与HCC97H的侵袭 过程，进而影响了 HCC97H细胞的转移过程。
权利要求
一种小干扰RNA，是序列表中序列4和5所示的核苷酸序列组成的双链RNA。
2. 编码权利要求1所述的小干扰RNA的DNA片段。
3. 如权利要求2所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段是式I所示的片段 SEQ正向一X—SEQ反向(I)其中，SEQ正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示； SEQ^^与所述SEQ^反向互补；X是SEQ^与SEQ^之间的间隔序列，X与所述SEQe^或者X与SEQ^^均不互补。
4. 根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于所述X是内含子，所述内含子的核苷 酸序列如序列表中序列3所示。
5. 含有权利要求2-4中任一所述DNA片段的重组载体。
6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将权利要求4所述 的DNA片段插入GCSilenCerTMU6/Neo/GFP载体的多克隆位点构建成的重组表达载体。
7. 权利要求1所述小干扰RNA、权利要求2-4中任一所述DNA片段或者权利要求5或 6所述的重组载体在制备抑制Rab27B基因表达产品中的应用；所述Rab27B基因是如下1) 或2):1) 核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第112-768位所示；2) 核苷酸序列如序列表中序列1所示。
8. 权利要求1所述小干扰RNA、权利要求2-4中任一所述DNA片段或者权利要求5或 6所述的重组载体在制备治疗肝细胞癌细胞转移的抑制剂中的应用。
9. 权利要求1所述小干扰RNA、权利要求2-4中任一所述DNA片段或者权利要求5或 6所述的重组载体在制备肝细胞癌细胞转移的药物中的应用。
10. 如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述肝细胞癌细胞为HCC97H细胞。
全文摘要
本发明公开了一种特异抑制Rab27B基因表达的DNA片段及其应用。本发明提供的小干扰RNA是序列表中序列4和5所示的核苷酸序列组成的双链RNA。本发明提供的DNA片段，如式I所示，其中，SEQ正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是内含子。实验证明本发明提供的DNA片段导入肝细胞癌细胞中，Rab27B蛋白表达量显著下调，并且敲低Rab27B后，HCC97H细胞体外增殖能力、体外黏附能力、体外迁移能力和体外侵袭能力都显著下降。SEQ正向-X-SEQ反向(I)
文档编号A61P35/02GK101787366SQ20101011855
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者姜颖, 孙薇, 贺福初, 魏汉东, 齐菲菲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所