专利名称：斑马鱼p-选择素基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于斑马鱼的P-选择素基因及其编码蛋白与应用，属基因工 程技术领域。
背景技术：
P-选择素亦称 CD62P,颗粒膜蛋白 140 (granular membrane protein 140， GMP140)，或血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白(platelet activation d印endent granule external membraneprotein, PAD GEM)，是选择素家族的重要黏附分子。P-选择素贮存于内皮细胞的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒中，正常内皮 细胞和血小板表面无P-选择素表达或呈持续低表达状态，当细胞受刺激(LPS、组胺、血栓 素、ADP、TNF- α等)活化后，P-选择素分泌到细胞表面。对血栓性心脑血管疾病的研究发现，血小板的活化在此类疾病的发生发展中起着 非常重要的作用。活化后血小板膜表面的许多糖蛋白，如P-选择素、GPIIb-IIIa等表达量 发生显著变化，其中P-选择素是近年来所认识的最具特异性的血小板活化的分子标记物。 P"选择素作为血小板/内皮细胞活化标志和细胞黏附受体，它可通过介导血小板、内皮细 胞黏附及与白细胞的相互作用，启动并参与包括炎症发生和血栓形成等多种病理生理起始 过程，是炎症/血栓的重要介质和靶分子。由于P-选择素在血栓形成中起重要作用，针对其的检测和抗粘附治疗已成为诊 断和治疗血栓性疾病的重要手段。以P-选择素及其配体为靶点来防治心脑血管疾病日益 受到国内外的关注，抗P-选择素及其配体治疗则有望成为心血管疾病干预的新靶点。斑马鱼已成为生物学研究的最佳脊椎动物模型之一。斑马鱼产卵周期短，产卵量 大，早期胚胎和仔鱼完全透明，可以动态观察体内血液循环，心脏跳动和其它器官形成。斑 马鱼基因组测序结果表明，斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85%，使得斑马鱼成为 一种研究人类疾病的模式动物，越来越受到人们的关注。同时，斑马鱼胚胎发育遗传学技术 的逐步建立和完善也为斑马鱼人类疾病模型的建立和分析提供了良好的基础。斑马鱼在与 人类疾病相关的基因及其功能和人类疾病模型的研究中已显示出重要的意义。目前，利用 斑马鱼作为整体动物模型进行高通量的筛选已成为斑马鱼研究的热点之一。基于已知疾病机制而建立的斑马鱼模型在几个领域快速发展，包括血液病、糖尿 病、肌肉萎缩、神经萎缩、血管生成和脂类代谢障碍。由于斑马鱼早期胚胎和仔鱼完全透明， 易观察血小板(又称血栓细胞)的形成和凝结等现象。因此，斑马鱼非常适用于血栓性疾 病的研究。斑马鱼的转基因技术已经相对成熟，很多转基因斑马鱼品系被建立，然而与血栓 症和血小板相关的转基因斑马鱼品系却很少。人、大鼠、小鼠等高等脊椎动物的P-选择素已被先后克隆。在低等脊椎动物中关 于P-选择素研究方面的报道极少。迄今为止，斑马鱼P-选择素基因的研究尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种斑马鱼P-选择素基因及其编码蛋白与应用。斑马鱼(Danio rerio)P-选择素基因，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。该P-选择素基因cDNA序列全长2800bp，有一个2607bp开放阅读框架，5'端非编 码区长lllbp，3'端非编码区长82bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。
由斑马鱼(Danio rerio) P-选择素基因编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列。蛋白保守结构域分析显示，该蛋白具有哺乳动物选择素家族分子膜外区3 种结构域1个C型凝集素样结构域，1个表皮生长因子样结构域，10个重复的补体结合蛋 白结构域。原位杂交实验证实，P-选择素基因在斑马鱼的循环系统表达，48小时的表达量比 24小时高。实时定量RT-PCR结果表明，促血小板活化物质ADP明显的促进P-选择素基因的 表达。这表明斑马鱼P-选择素基因在血栓形成中起重要作用。本发明的P-选择素基因，可用于构建转基因斑马鱼，构建的转基因斑马鱼可用于 研究血栓类疾病的发病机理，筛选预防和治疗血栓类疾病的药物。本发明的斑马鱼P-选择 素基因及其编码蛋白也可用于制备预防和治疗血栓类疾病的药物。
图1是P-选择素基因在24和48小时斑马鱼胚胎表达的整体原位杂交结果(A)P-选择素基因在24小时斑马鱼胚胎的循环系统表达(B)P-选择素基因在48小时胚胎的循环系统表达图2是ADP促P-选择素表达的实时定量RT-PCR结果*表示处理组与对照组有显著差异
具体实施例方式下列实施例中实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1序列比对以小鼠的P-选择素蛋白序列(GenBank :AAA40008)在斑马鱼蛋白和基因组数据库 进行比对，获得与其同源性最高的蛋白序列(GenBank :XP_001336824)，并分析该蛋白序列 对应的核苷酸序列。实施例2获得斑马鱼P-选择素基因的cDNA序列1.斑马鱼总RNA的提取和第一链cDNA的获得利用Invitrogen公司生产的Trizol试剂，由3-7天AB系斑马鱼仔鱼中提取总 RNA。提取的总RNA，经Promega公司反转录酶转录得到第一链cDNA。2.引物设计根据分析得到的核酸序列设计特异引物如下。F 5' -CCTGGACTTACCATTACAACATC-3‘ (SEQ ID NO. 3)R5' -CAAGTACAAAACAACATGAACA-3‘ (SEQ ID N0. 4) 3.PCR 扩增
根据Takara公司LA Taq酶使用说明书进行PCR扩增，扩增条件94°C预变性 3min;再 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，共 35 个循环；最后 72°C IOmin0 扩增片段纯化、 回收，根据Promega公司pGEM_T载体说明书克隆入pGEM_T载体，内切酶检验有插入片段后 测序，测序结果表明该PCR产物具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中自5'端185位至 2768位序列。4. RACE克隆得到斑马鱼P-选择素基因全长cDNA序列根据大连宝生物公司提供的3' -RACE试剂盒说明书进行3' -RACE快速扩增 cDNA 末端，其中 3 ‘ -RACE 特异引物 F 5 ‘ -CCTTTTGCTTGGCTCAAGAG-3 ‘ (SEQ ID NO. 5)， 扩增条件94°C预变性3min;再94°C 30s, 55°C 30s,72°C 2min，共35个循环；最后72°C IOmin0扩增片段纯化、回收，根据Promega公司pGEM_T载体说明书克隆入pGEM_T载体，内 切酶检验有插入片段后测序。序列分析结果表明，获得了斑马鱼P-选择素基因的cDNA3' 序列(SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中自5'端2129位至2800位)。再根据Clontech 公司提供的5 ‘ -RACE试剂盒说明书进行5 ‘ -RACE快速扩增cDNA末端。其中5 ‘ -RACE 特异引物 R:5' -CGTTCGCGATGGGTTTCAGTGAGTCACA-3' (SEQ ID NO. 6)，扩增条件94°C预 变性 5min ；再 94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 2min，共 35 个循环；最后 72°C IOmin0 扩增片段纯 化、回收，依据Promega公司pGEM_T载体说明书克隆入pGEM_T载体，内切酶检验有插入片 段后测序，测序结果表明获得斑马鱼P-选择素cDNA基因5'序列(SEQ ID NO. 1所示的脱 氧核苷酸序列中自5'端1位至1243位序列)。将前面得到序列拼接，拼接结果表明得到 斑马鱼P-选择素基因的cDNA序列，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。5.拼接得到的全长cDNA正确性验证为验证拼接得到的cDNA序列全长正确性，根据拼接得到斑马鱼P-选择素基因的 全长 cDNA 序列设计特异引物 F 5' -CAGTGCAACTGTCTAAATAGTAAATC-3‘ (SEQ ID N0. 7)和 R 5' -ACGTATTAATTCATTTATTGCAAGTA-3‘ (SEQ ID N0. 8)。根据 Takara 公司 LA Taq 酶使 用说明书进行PCR扩增，扩增条件94预变性5min ；再94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 3min，共35 个循环；最后72°C IOmin0扩增片段纯化、回收，根据Promega公司pGEM_T载体说明书克 隆入pGEM-T载体，内切酶检验有插入片段后测序，测序结果表明，该PCR产物具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。自5'端112位核苷酸至2718位核苷酸编码具有SEQ IDN0. 2所 示的氨基酸残基的P-选择素蛋白，是P-选择素蛋白的编码区。实施例3斑马鱼原位杂交LRNA探针合成根据P-选择素基因全长cDNA序列，选择从679-1278长600bp的DNA片段作为模 板合成地高辛标记的RNA探针。1.1设计引物F:CAAGGTCTTGTGAAGTGTGAC(SEQ ID NO. 9)R :AAACTCATCGACAGAGTCAT(SEQ ID NO. 10)1.2PCR 扩增根据Takara公司Taq酶使用说明书进行PCR扩增，扩增条件94°C预变性5min ；再 940C 30s, 680C 30s, 72°C lmin，共35个循环；最后72°C IOmin0扩增片段纯化、回收，根据 Promega公司pGEM_T载体说明书克隆入pGEM_T载体，内切酶检验有插入片段后测序。
1. 3重组质粒制备扩增片段与promega公司的pGEM-T载体重组，具体步骤根据说明书进行。1. 4质粒线性化用Takara公司的限制性内切酶NcoI使 重组质粒充分线性化，具体步骤按说明书 进行。线性化重组质粒采用Promega公司的核酸纯化试剂盒纯化，具体步骤按说明书进行。1. 5探针标记采用线性化的质粒为模板，用Roche公司的DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)进行 RNA探针标记。反应体系如下NcoI线性化质粒 IygIOX 转录 buffer 2μ 1IOXNTP2μ 1RNase inhibitor 1 μ 1SP6RNA 聚合酶2 μ 1DEPC H2O 至20 μ 137 °C孵育2小时，力口入2 μ IDnase 1,37 °C孵育15分钟；力口入2 μ 1 0. 2MEDTA(pH8. 0)终止反应。转录产物中加入2. 5 μ 1 4Μ LiCl,75μ 1预冷无水乙醇，混勻 后_20°C静置2小时，离心，收集沉淀；75%乙醇洗涤、干燥后溶于50 μ 1 DEPC处理水。2.斑马鱼固定和脱水收集发育至24和48小时胚胎，用Sigma公司蛋白酶K去除卵膜，4%多聚甲醛固 定，4°C保存过夜。固定结束，用25%甲醇/PBST、50%甲醇/PBST、75%甲醇/PBST和无水 甲醇各处理1次，10分钟/次，然后置于新鲜甲醇，-20°C保存，待用。(超过24h的胚胎经 0.003%苯硫脲处理，以防止黑色素的形成。)3.胚胎复水与重固定胚胎从_20°C保存的甲醇取出，依次经75%甲醇/PBST、50%甲醇/PBST、25甲醇/ PBST各1次，PBST洗3次，10分钟/次。在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。再用PBST 洗3次，10分钟/次。4.蛋白酶K处理与后固定用10μ g/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。24小时的胚胎不用处理，48小时胚 胎处理30分钟。PBST溶液轻洗3次，5分钟/次。室温下用4%多聚甲醛固定20分钟，用 PBST洗3次，5分钟/次。5.预杂交每组处理样品加入500μ 1 HYB(_)，65°C水浴5分钟，避免振荡。用等体积的 HYB⑴取代HYB㈠，65°C水浴预杂交4小时以上。6.杂交去除HYB⑴，加上含探针的100 μ 1 HYB⑴，探针浓度为Ing/ μ 1，65°C温浴过夜。HYB(-) :50% 甲酰胺、5XSSC、0. Tween-20HYB(+) :50% 甲酰胺、5XSSC、0. 1% Tween_20、500ug/ml 酵母 tRNA、50ug/ml 肝素， 柠檬酸调PH至7.0。7.清洗
在65°C杂交温度下清洗胚胎，50%甲酰胺/2XSSCT(2XSSC+0. l%Tween-20)清洗2 次，30 分钟 / 次；2XSSCT(2XSSC+0. 1 % Tween-20)洗 1 次，15 分钟；0. 2XSSCT (0. 2XSSC+0. 1% Tween-20)洗2次，30分钟/次。8.封闭室温下，用MABT平衡3次，5分钟/次。
MABT IOOmM 马来酸(用 5M NaOH 调 pH 至 7. 5)150mMNaCI0. 1 % Tween-20加入封闭液室温缓慢摇动封闭2小时以上。封闭液MABT2% blocking reagent10%灭活小羊血清9.抗体结合更换新鲜封闭液，按1/5000的比例加入耦联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体，4°C过 夜。10.清洗用含10%灭活羊血清的MABT缓慢摇动25分钟，MABT缓慢摇动清洗3次，时间分 别是25分钟，1小时以上，25分钟。再用染色缓冲液平衡3次，5分钟/次。染色缓冲液IOOmM Tris50mM MgCl2IOOmM NaCI0. 1% Tween-20ImM左旋咪唑11.显色将胚胎移入24孔板，加入含5mM左旋咪唑的显色液NBT/BCIP，避光室温显色。原 位杂交结果表明，斑马鱼P-选择素基因在24和48小时胚胎的循环系统表达，48小时胚胎 P-选择素的表达量比24小时高(如图1所示)。实施例4实时定量RT-PCR1. RNA提取和第一链cDNA的合成用100 μ M ADP处理72小时斑马鱼，处理时间为2、8、15和30min，未处理组作为 对照。利用Invitrogen公司生产的Trizol试剂，从处理组和未处理组斑马鱼提取总RNA。 提取的总RNA，经Promega公司反转录酶转录得到第一链cDNA。
2.实时定量PCR2. 1引物设计根据斑马鱼β -actin (GenBank :NM_131031)和P_选择素基因的全长cDNA序列设 计引物。β-actin:
F5' -TGGCTTCTGCTCTGTATGGC-3‘ (SEQ ID NO. 11)R5' -CCCTGTTAGACAACTACCTCCCT-3，(SEQ ID NO. 12)P-选择素F5' -TCGGGCATACTACTGGATTG-3，(SEQ ID NO. 13)R5' -GGTTATTCGGTTCATTTGTCG-3，(SEQ ID NO. 14)2. 1将扩增后的模板cDNA进行10倍梯度稀释设定PCR产物浓度为1，分别稀释 为 1 X IO"1,1 X IO"2,1 X IO"3,1 X IO"4,1 X IO"5,1 X IO"6,1 X IO"7 梯度浓度的 DNA,以制备 P-选 择素和β-actine的标准曲线。2. 2梯度稀释的DNA模板以及所有待测cDNA样品分别配置Real-time PCR反应体 系IOXPCR 缓冲液(Promega)2. 5 μ 125mMMgCl2 溶液(Promega)3μ 120uM 上游引物0. 5μ120uM 下游引物0. 5μ12. 5mM dNTP 混合液(Promega)3μ 1Taq 聚合Sl (Promega)3unitscDNA1 μ 1SYBR green I (Invitrogen :Cat. No. S-7567)终浓度 0. 25 X加水至总体积为25 μ 1PCR反应条件如下。β -actin 95°C，5min ；35 个 PCR 循环95°C 10 秒，59°C 15 秒，72°C 20 秒；在 78°C收集荧光 5 秒。P-选择素95°C，5min ；40 个 PCR 循环95°C 10 秒，59°C 15 秒，72°C 20 秒；在 81.5°C 收集荧
光5秒。扩增反应结束后继续从72°C缓慢加热到95°C (每5秒升高1°C )，以建立PCR产 物的熔解曲线。2. 3PCR产物与IOObpDNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR
产物是否为单一特异性扩增条带。2. 4各样品的目的基因和管家基因分别进行Real-time PCR反应。系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数进行分析绘制 每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特 定阈值时的扩增循环数(Ct值)。2. 5标准曲线建立根据梯度稀释各样品Ct值与各自稀释倍数作图，得到该基因的标准曲线。2. 6根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，得到各样品目的基因和管家基因的浓度结果。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。2. 7数据处理
实验所得数据采用均数士标准差表示，用SPSS 15. 0统计软件分析，差异显著性 检验采用单因素方差分析，P < 0. 05为差异有统计学意义。用2_ΔΔ"方法分析实时定量PCR实验中基因表达相对变化。以未处理组P-选择 素基因的表达作为参照因子分析结果。实时定量RT-PCR结果表明，ADP处理组P-选择素表达量均比对照组高，处理组与 对照组均有显著差异。处理后2分钟表达量已显著升高，处理后8分钟表达量最高，处理后 15分钟和30分钟表达量开始下降(如图2所示)。
权利要求
斑马鱼P-选择素基因，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.由如权利要求1所述的斑马鱼P-选择素基因编码的蛋白质，具有如SEQID N0.2所 示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的斑马鱼P-选择素基因，在制备预防和治疗血栓类疾病药物中的应用。
4.如权利要求2所述的斑马鱼P-选择素基因编码的蛋白质，在制备预防和治疗血栓类 疾病药物中的应用。
5.权利要求1所述斑马鱼P-选择素基因，在构建转基因斑马鱼中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种斑马鱼P-选择素基因和蛋白。该斑马鱼P-选择素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的斑马鱼P-选择素基因可用于构建转基因斑马鱼，构建的转基因斑马鱼可用于研究血栓类疾病的发生机理，筛选抗血栓类药物。本发明的斑马鱼P-选择素基因及其编码蛋白也可用于制备预防和治疗血栓类疾病的药物。
文档编号A61K48/00GK101831433SQ201010169969
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者刘可春, 孙桂金, 王希敏, 王思锋, 王雪 申请人:山东省科学院生物研究所