Slc17a5基因及其编码蛋白在制备治疗或诊断与硝酸盐转运或代谢障碍或异常相关疾病 ...的制作方法
【专利摘要】本发明公开了SLC17A5基因及其编码蛋白在制备治疗或诊断与硝酸盐转运或代谢障碍或异常相关疾病药物中的用途。本发明通过大量的实验最终确证了SLC17A5基因编码蛋白（Sialin蛋白）为哺乳动物硝酸盐转运蛋白，可以将SLC17A5基因或其编码蛋白制备成治疗体内硝酸盐转运、代谢障碍相关疾病及抗高血压、抗休克、治疗心肌梗死及预防胃溃疡等的药物。
【专利说明】SLC17A5基因及其编码蛋白在制备治疗或诊断与硝酸盐转运或代谢障碍或异常相关疾病药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及SLC17A5基因及其编码蛋白的医药用途，尤其涉及SLC17A5基因及其编码蛋白在制备治疗与机体内硝酸盐转运或代谢障碍相关疾病药物中的用途，属于SLC17A5基因及其编码蛋白的医药用途领域。
【背景技术】
[0002]硝酸盐是自然界广泛存在的一种无机物。最初哺乳动物机体内的硝酸盐被当作是一氧化氮的代谢产物，不具有生物学活性。后来人们逐步认识到酸化的硝酸盐具有杀菌作用，可参与宿主防御，因此对于硝酸盐的认识有了新的变化。近年来的研究表明，硝酸盐还具有调节血压、调节血管张力、作为神经信号和免疫调节的功能，对于口腔、消化道感染、高血压、休克、心肌梗死以及胃溃疡等疾病具有潜在的治疗价值。
[0003]硝酸盐的生理功能依赖于硝酸盐一亚硝酸盐一一氧化氮途径。一氧化氮是一种具有重要生理功能的气体分子。一直以来一氧化氮合成酶以L-精氨酸为底物合成一氧化氮途径被认为是机体一氧化氮的唯一来源，而硝酸盐则被当成无生理功能的代谢产物或作为一氧化氮合成的检测指标。从1994年开始两个研究小组发现，硝酸盐和亚硝酸盐在缺氧和酸性条件下可以还原为一氧化氮。这种非酶源性的一氧化氮途径(硝酸盐一亚硝酸盐一一氧化氮途径)不仅在缺氧和酸性条件下可以发生，在正常生理条件下，许多组织和细胞也会利用这种非酶源性途径产生一氧化氮，行使生理功能。
[0004]硝酸盐在机体内的转运依赖于“胃肠——唾液腺循环”。饮食中的硝酸盐被胃、十二指肠吸收后进入血液和内源性产生的硝酸盐一起运行于血液循环中，血循环中的大部分硝酸盐直接排出体外不能被利用，其中60%~70%由尿液排出体外，少量由粪便(低于1%)和汗液(低于10%)排出体外。约20%~25%的硝酸盐被唾液腺主动性地从血液中摄取，浓缩并分泌进入唾液，唾液硝酸盐浓度约为血液硝酸盐的5倍~10倍。
[0005]由唾液腺分泌的硝酸盐可被口腔内兼性厌氧菌中的硝酸盐还原酶还原为亚硝酸盐，这样唾液中就既含有硝酸盐也含有亚硝酸盐了。唾液被吞咽后进入胃和小肠，硝酸盐和亚硝酸盐被再次吸收而再利用，完成“胃肠一唾液腺循环”，这个循环既保障了硝酸盐的有效利用，也提供稳定的亚硝酸盐来源。因为哺乳动物缺乏硝酸盐还原酶，所以由唾液硝酸盐还原的亚硝酸盐是机体重要的亚硝酸盐来源。高浓度的外来亚硝酸盐，如来自亚硝酸盐污染的食物或饮水，可导致亚硝酸盐的不良反应。但引起不良反应的浓度较高(mM~M)，而有生理功能的亚硝酸盐浓度极低(nM~μ M)。
[0006]在机体硝酸盐“胃肠一唾液腺循环”和硝酸盐一亚硝酸盐一一氧化氮途径中，唾液腺起到极其重要的作用。唾液硝酸盐有着许多重要的生理功能，如杀死口腔以及上消化道常见的细菌、微生物或抑制其生长，调节胃肠功能，以及提供机体非酶源性一氧化氮的前体物质一亚硝酸盐。对于唾液以及食物中的硝酸盐、亚硝酸盐的认识最近20年来有了很大改变，由更多地关注其消极因素转而更多地关注其积极因素。[0007]在整个“胃肠一唾液腺循环”和硝酸盐一亚硝酸盐一一氧化氮途径的体系中，到目前为止，硝酸盐和亚硝酸盐如何在体内转运还没有报道。植物能够吸收和利用土壤中的硝酸盐以供应体内代谢所需的氮元素，植物对硝酸盐的吸收无论是高浓度环境还是低浓度下都是主动转运的过程，而非离子扩散。植物根系和酵母等低等生物硝酸盐转运体系研究比较清楚，已经克隆出多个转运通道。低等生物硝酸盐转运通道属于从低等生物到高等生物高度保守的膜转运体主要辅助因子超家族(major facilitatorSuperfamily，MFS)，具有膜转运蛋白的典型特征，具有十二个跨膜结构域。人类和其它哺乳动物硝酸盐转运通道还未有报道。
[0008]1999年发现一个新发现的基因(SLC17A5)，SLC17A5位于6ql4_ql5，开放阅读框架有1485bp。SLC17A5编码唾液酸转运蛋白(Sialin)，属于主要辅助因子超家族(major
facilitator superfamily, MFS)中的一个亚家族-阴阳离子共转运体(anion/cationsymporters, ACS)家族。Sialin蛋白由495个氨基酸组成,拥有12个跨膜结构,氨基端(N端)和羧基端(C端)位于细胞浆侧。SLC17A5的突变会导致两种主要的唾液酸储存病:快速进展型的婴儿唾液酸储存病(infantile sialic acid storage disease, ISSD)和进展缓慢的成人型(Salla disease, SD),还存在一种介于两者之间的中间型，即严重型SD。Sialin最初被认为位于细胞内的溶酶体膜上，特异性转运溶酶体内的游离唾液酸(free sialicacid, free SA)进入细胞浆，SLC17A5突变造成Sialin蛋白部分和全部功能的丧失，导致发育和神经功能障碍。随后的研究表明，Sialin不仅在中枢和周围神经系统中表达，而且在非神经系统中也广泛表达，突触上的Sialin蛋白具有转运天门冬氨酸和谷氨酸的能力，提示其还具有其它的生理功能。
【发明内容】
[0009]本发明的主要目的是提供SLC17A5基因及其所编码蛋白的一种新的医药用途。
[0010]本发明通过大量的实验证实SLC17A5基因编码蛋白(Sialin)为哺乳动物硝酸盐转运蛋白，与动物机体内硝酸盐的转运和代谢密切相关。机体利用硝酸盐“胃肠——唾液腺循环”和硝酸盐一亚硝酸盐一一氧化氮途径这一体系发挥重要生理功能如调节血压、调节血管张力、作为神经信号和免疫调节；其具有广阔的疾病治疗前景如治疗感染、高血压、休克、心肌梗死以及胃溃瘍(Cosby K, et al.(2003)Nitrite reductionto nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.NatMed9(12):1498-1505 ;Gladwin MT, et al.(2000)Relative role of heme nitrosylationand beta-cysteine93nitrosation in the transport and metabolism of nitric oxideby hemoglobin in the human circulation.Proc Natl Acad Sci USA97(18):9943-9948 ；Lundberg JO,Weitzberg E,&Gladwin MT (2008)The nitrate-nitrite-nitric oxidepathway in physiology and therapeutics.Nat Rev Drug Discov7 (2):156-167 ；Lundberg JO, Carlstrom M, Larsen FJ, &ffeitzberg E(2011)Roles of dietary inorganicnitrate in cardiovascular health and disease.Cardiovasc Res89(3):525-532.X在这一体系中硝酸盐能否在机体内的有效转运和代谢作用至关重要。涎腺功能障碍(放射性涎腺损伤、Sjogren’s syndrome等)及SLC17A5基因突变导致的遗传性疾病——唾液酸储存病(SASD)影响这一体系的有效运行及机体功能(Xia DS, Deng DJ, &ffangSL(2003)Destruction of parotid glands affects nitrate and nitrite metabolism.J Dent Res82(2):101-105 ;Xia D,Deng D,&ffang S (2003)Alterations of nitrateand nitrite content in saliva, serum, and urine in patients with salivarydysfunction.J Oral Pathol Med32 (2):95-99 ；Verheijen FW, et al.(1999)A newgene, encoding an anion transporter, is mutated in sialic acid storage diseases.Nat Genet23 (4):462-465.)。因此，可以将SLC17A5基因或其编码蛋白制备成治疗体内硝酸盐转运、代谢障碍相关疾病及抗高血压、抗休克、治疗心肌梗死及预防胃溃疡等的药物。
[0011]其中，所述SLC17A5基因(mRNA)的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示；SLC17A5基因编码蛋白(Sialin)的氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。[0012]为了实现上述目的，本发明首先进行了 “胃肠一唾液腺循环”干扰研究实验。实验结果表明，唾液腺功能低下患者(Sjogren’s syndrome, SS)唾液中硝酸盐、亚硝酸盐显著减少，而尿液中明显升高。实验结果提示唾液腺功能障碍阻碍了硝酸盐和亚硝酸盐代谢，唾液腺是机体硝酸盐转运的重要器官。
[0013]本发明通过阻断大鼠硝酸盐“胃肠一涎腺循环”实验发现，唾液腺在机体硝酸盐“胃肠——涎腺循环”和硝酸盐——亚硝酸盐一一一氧化氮途径中具有极其重要的作用。
[0014]在此基础上本发明继续进行了大鼠应激实验，实验结果表明唾液腺不仅在维持机体硝酸盐平衡方面具有重要作用，同时唾液硝酸盐分泌障碍严重影响全身尤其是消化系统健康。本发明通过进一步的研究证实，唾液腺组织能主动的摄取硝酸盐而在唾液腺组织浓集。通过基因芯片分析，本发明发现唾液腺高表达SLC17A5 ；RT-PCR和Western Blot证实SLC17A5和Sialin在唾液腺中的表达高于全身其他器官。通过对唾液腺细胞进行膜片钳电生理研究发现，唾液腺细胞膜上存在着强硝酸盐转运通道且与已知的对硝酸盐离子有弱转运能力的氯离子通道1-3 (C1CN1-3)在电生理上完全不一样。这个独特的强硝酸盐转运通道具有硝酸盐离子/质子共转运体特征，质子可以促进硝酸盐离子向细胞内的转运，同样细胞外的硝酸盐离子也可以辅助质子内流。而且这个唾液腺细胞强硝酸盐转运通道同样具有转运亚硝酸盐、SA和天门冬氨酸和谷氨酸的能力，电生理特征与硝酸盐一致。根据以上电生理特征本发明对SLC17A5基因及其编码蛋白进行深入的研究:
[0015]首先进行SLC17A5表达蛋白Sialin的定位研究，通过免疫组织化学、WesternBlot和Confocal研究发现，Sialin不仅在细胞内的溶酶体膜上表达，而且在细胞膜上也有表达，唾液腺组织上，Sialin主要定位于唾液腺腺泡细胞的基底膜上，这为Sialin行使离子转运功能提供了有利的证据。
[0016]在此基础上，本发明通过shRNA技术转染SLC17A5 shRNA后检测唾液腺细胞转运硝酸盐能力。实验结果显示，SLC17A5基因抑制后，唾液腺细胞独特的强硝酸盐转运通道被有效抑制，其电信号下降50%以上，细胞摄取硝酸盐的能力也大大下降。同样细胞摄取已知Sialin底物SA的能力也同样下降。而转染了细胞膜高表达的SLC17A5后，强硝酸盐转运通道功能得到了增强。以上结果提示Sialin与硝酸盐转运密切相关。
[0017]为了检验导致ISSD和SD的天然突变体是否影响硝酸盐的转运，本发明在细胞和动物实验上转导SLC17A5天然突变体H183R和R39C。H183R和R39C突变分别会导致快速进展型的婴儿唾液酸储存病(ISSD)和进展缓慢的成人型(SD)。结果显示H183R和R39C转染唾液腺细胞后导致强硝酸盐转运通道功能显著下降，而H183R下降比R39C明显。H183R转染正常成纤维细胞后，其硝酸盐转运通道功能也显著下降，提示硝酸盐转运通道不仅存在于唾液腺细胞中，同样存在于全身其它细胞中，但成纤维细胞转运能力仅为唾液腺细胞的1/30。ISSD患者的成纤维细胞转运能力较正常成纤维细胞转运硝酸盐能力下降约75%。
[0018]本发明通过小型猪腮腺导管逆行转导H183R突变体，并检测唾液硝酸盐发现，H183R突变导致唾液硝酸盐显著下降。
[0019]根据上述一系列实验结果，本发明最终确证了 Sialin蛋白为哺乳动物硝酸盐转运蛋白。因此可以将SLC17A5基因制备成基因治疗药物转导治疗放射性涎腺损伤、Sjogren’s syndrome和唾液酸储存病(SASD)导致的硝酸盐转运或代谢障碍。此外,还可以将Sialin蛋白制备成通道激动剂治疗高血压、休克、心肌梗死及胃溃疡疾病。作为诊断上的医疗用途，可以 将SLC17A5基因制备成基因芯片或将Sialin蛋白制备成蛋白芯片进行闻血压基因筛查。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1 Sialin定位及表达实验结果。
[0021]图2转染效力验证实验结果。
[0022]图3 Salin基因抑制后膜电流下降。
[0023]图4 Sialin基因抑制后唾液腺细胞摄取硝酸盐能力。
[0024]图5 Sialin基因突变与HSG细胞硝酸盐转运功能实验结果。
[0025]图6 ISSD患者成纤维细胞硝酸盐转运功能实验结果。
[0026]图7正常成纤维细胞转染sialinH183R后细胞硝酸盐转运功能。
[0027]图8 Sialin基因突变与硝酸盐转运功能研究体内实验结果。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0029]实验例I “胃肠一唾液腺循环”干扰研究实验
[0030]实验结果表明，唾液腺功能低下患者(Sjogren’s syndrome, SS)唾液中硝酸盐、亚硝酸盐显著减少，而尿液中明显升高。健康志愿者唾液硝酸盐浓度为990.1±46.5μΜ，亚硝酸盐浓度为122.2±17.6yM;S S患者唾液硝酸盐浓度为227.6 ± 17.6 μ M，亚硝酸盐浓度为79.9±38.8μΜ。健康志愿者尿液中硝酸盐浓度为1584.2±653.4yM，SS患者尿液中硝酸盐浓度为4603.9±2188.1 μ Μ。腮腺萎缩小型猪实验同样显示腮腺萎缩导致小型猪唾液硝酸盐、亚硝酸盐显著减少，尿液中明显升高。
[0031]实验结果提示唾液腺功能障碍阻碍了硝酸盐和亚硝酸盐代谢，唾液腺是机体硝酸盐转运的重要器官。
[0032]实验例2阻断唾液腺硝酸盐分泌导致胃粘膜保护作用下降实验
[0033]1、实验材料和方法
[0034]I)腮腺和颌下腺导管结扎阻断唾液腺硝酸盐分泌[0035]230 - 250g SD雄性大鼠10%水合氯醛麻醉下切开皮肤，结扎双侧腮腺和颌下腺导管(P&SDL)。手术对照组(sham):切开皮肤不结扎导管。
[0036]2)大鼠应激实验
[0037]采用浸水束缚应激(water-1mmmersion-restraint, WIR)实验。SD雄性大鼠禁食18-20小时，禁水I小时后将其束缚于大鼠固定器中，垂直浸入20 ± 2 °C水中，水平面至剑突水平，持续4小时 。
[0038]3)收集大鼠胃液检测硝酸盐和亚硝酸盐
[0039]行幽门结扎术，2h后收集胃液。以3000r/min离心lOmin，取上清液加入0.5%的
0.1M NaOH缓冲液防止亚硝酸盐的降解。Neos印超滤管(3KDa)，14000g离心20分钟，去除大分子蛋白质备用。硝酸盐、亚硝酸盐检测采用R&D公司的Nitrate/Nitrite Kit。
[0040]4)大鼠胃内一氧化氮(NO)气体检测及胃粘膜表面血流测定
[0041]Interscan4000 一氧化氮气体数字分析仪(InterScan, USA)检测胃内一氧化氮气体，激光多普勒血流仪(PeriFlux4001Master and PeriFluxPf3;Perimed, Stockholm, Sweden)检测胃粘膜表面血流。
[0042]2、实验结果
[0043]I)唾液硝酸盐阻断降低了胃液硝酸盐亚硝酸盐的浓度及胃内NO水平
[0044]大鼠双侧唾液腺导管结扎一星期以后，胃内硝酸盐、亚硝酸盐及NO水平明显降低。胃液硝酸盐水平由sham组的52 ± 22 μ M降低到P&SDL组的25 ± 15 μ M (P < 0.05，η=12)，此外，亚硝酸盐水平由2.04±0.61 μ M降低到 0.88±0.27 μ Μ(Ρ < 0.01，η=12)。胃内NO含量从 78±43ppb 降低为 36±15ppb(P < 0.05，n=12)。
[0045]2)唾液硝酸盐阻断降低了胃粘膜表面血流，加重了胃粘膜应激损伤。
[0046]P&SDL大大降低的胃粘膜表面血流，由sham组的47.24±18.33PU降低为P&SDL组的35.03 + 10.79PU(P < 0.05，n=12)，与此同时，胃粘膜损伤程度加重，UI指数由sham组的23.62±8.45mm 上升为 P&SDL 组的 41.83±18.47mm(P < 0.01，n=12)。
[0047]以上实验结果表明，唾液腺不仅在维持机体硝酸盐平衡方面具有重要作用，同时唾液硝酸盐分泌障碍严重影响全身尤其是消化系统健康。
[0048]实验例3 Sialin的定位及表达实验
[0049]1、实验材料和实验方法
[0050]取人腮腺、颌下腺标本，生理盐水冲洗后，用4%的多聚甲醛(溶于0.1M PBS溶液中)固定24h。脱水、固定、包埋。切片(4μπι厚)后脱蜡，水化，枸盐酸微波修复抗原。常规免疫组化流程，采用免疫双标法检测蛋白的表达和定位。
[0051]1.1 Sialin与溶酶体膜标记蛋白共定位实验
[0052]抗Sialin—抗为:羊抗人 Sialin IgG 抗体(Santa Cruz, CA, USA),稀释倍数为 1:1OO0 抗 LAMP-1 (Lysosomal-associated membrane proteinl) 一抗为:小鼠抗人LAMP-1 IgG 抗体(Santa Cruz, CA，USA)，稀释倍数为 1:50。二抗分别为 Dylight649 标记的兔抗羊IgG(H+L) 二抗(KPL, Gaithersburg, USA)以及FITC标记的驴抗鼠IgG 二抗(Proteintech, Chicago, USA)。
[0053]1.2 Sialin与细胞膜标记蛋白共定位实验
[0054]抗Sialin — 抗为:羊抗人 Sialin IgG 抗体(Santa Cruz, CA, USA),稀释倍数为 1:100。抗 Na+/K+ATPase — 抗为:小鼠抗人 Na+/K+ATPase IgG 抗体(SantaCruz，CA，USA)，稀释倍数为1:50。二抗分别为Dylight649标记的兔抗羊IgG(H+L) 二抗(KPL, Gaithersburg, USA),以及FITC标记的驴抗鼠 IgG二抗(Proteintech, Chicago, USA)。
[0055]采用Leica共聚焦荧光显微镜检测唾液腺组织免疫荧光。
[0056]2、实验结果 [0057]Sialin蛋白在唾液腺腺泡细胞上不仅表达于胞浆中同时在细胞膜上也有表达。Sialin蛋白主要表达于腺泡细胞的基底膜和侧膜。通过与细胞膜标记蛋白Na7K+ATPase共定位研究发现，Sialin与Na+/K+ATPase在细胞膜上完全重叠，提示Sialin与Na+/K+ATPase一样具有细胞膜转运功能。胞浆中的Sialin呈现散在不均匀表达。通过与溶酶体膜标记蛋白LAMP-1共定位研究发现，Sialin与LAMP-1部分重叠，符合溶酶体膜和微囊膜蛋白的特点(图1)。
[0058]实验例4 Sialin(SLC17A5)基因抑制和细胞膜过表达研究细胞硝酸盐转运功能实验
[0059]1、实验材料和方法
[0060]I)细胞转染
[0061]2 X IO5人颌下腺细胞系(human submandibular gland cells, HSG cells,由 InduS.Ambudkar, Molecular Physiology and Therapeutics Branch, National Institute ofDental and Craniofacial Research，NIH，USA提供)细胞传代接种于6孔板中，培养基为含10%胎牛血清，2mM左旋谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素的DMEM-F12，37℃，5%C02培养箱培养。24小时后，细胞50-70%汇合，更换新鲜培养基，加入转染试剂混合物，均匀加入到整个孔内，随后轻轻混匀。
[0062]Sialin shRNA (sh-sialin)转染试剂混合物含无血清培养基100 μ 1，TurboFectin?8.06.0 μ I 及 sh-sialin 质粒 2.0 μ g。s hRNA 阴性对照质粒(scrambledshRNA, scram-sh)为 pRS shRNA 载体带 29bp 对 SLC17A5 无效的序列。
[0063]膜过表达转染试剂混合物含无血清培养基100 μ 1，TurboFectin?8.06.0 μ I,sialinL22AL23A 质粒 2.0 μ g0
[0064]sh-sialin (TR309394)Λscram-sh (TR30003)和 TurboFectin?8.0 均购自 Origene公司。sialinL22AL23A 质粒由 William A.Gahl (Medical Genetics Branch, NationalHuman Genome Research Institute，NIH，USA)和 Changyu Zheng (Molecular Physiologyand Therapeutics Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research，NIH, USA)提供。转染48小时后裂解细胞，并提取细胞膜蛋白，Western blot在蛋白水平验证转染效力。
[0065]2)细胞膜电生理检测
[0066]3)细胞外液离子成分改变后检测细胞膜电流变化，釆用标准全细胞膜片钳方法检测细胞膜电流，其方法参照文献(Liu X，Liao Dj Ambudkar IS(2001)Distinct mechanismsOftCa2+Ji oscillations in HSY and HSG cells:role of Ca2+influx and internalCa2+Store recycling.J Membr Bioll81:185-193.)。
[0067]4)细胞硝酸盐摄取实验
[0068]细胞外液硝酸盐离子加载后检测细胞内硝酸盐离子变化。硝酸盐离子加载后O~25分钟内选择不同时点去离子水裂解细胞，收集裂解液检测裂解液中硝酸盐离子浓度，以蛋白浓度校正。离子对高相液相色谱(ion-pair high-performance liquidchromatograhy, 1n-pair HPLC)法检测硝酸盐离子浓度。1n-pair HPLC方法如下:Water?高相液相色谱系统，流动相为17%有机相(乙腈)和83%的无机相(pH3.9磷酸钠缓冲液，内含3.0mM TBAOH)ο流速为0.4mL/min。205nm波长检测硝酸盐阴离子。0-200 μ MNaNO3梯度稀释，作为标准品，建立线性关系标准曲线，Empower软件分析。以待测样品峰面积换算出样品硝酸盐含量。
[0069]2、实验结果
[0070]I) Western blot结果显示:sh-sialin有效地抑制了 sialin在细胞膜表达，sialinL22AL23A显著增加了 sialin在细胞膜表达(图2)。
[0071]sialinL22AL23A具有和野生型sialin相同的转运功能，而且特异性地在细胞膜表达(Wreden CC, Wlizla M, Reimer RJ(2005) Varied mechanisms underlie the freesialic acid storage disorders.J Biol Chem280:1408-1416)。
[0072]2)电生理检测结果
[0073]Sialin基因抑制后细胞外液5mM硝酸盐离子(N03_)、唾液酸离子(SA)或硝酸盐离子+唾液酸离子(SA+N03_)加载后产生的膜电流较对照组显著下降50%以上(图3，P<0.01，n=5_10)
[0074]sialinL22AL23A转染增加sialin细胞膜表达，细胞外液15mM硝酸盐离子(N03_)、唾液酸离子(SA)加载后产生的膜电流较对照组显著增加约I倍(P < 0.01，n=5-6)。
[0075]3)细胞硝酸盐摄取实验
[0076]Sialin基因抑制后细胞外液15mM硝酸盐离子(N03_)加载，pH7.2，10~25分钟后细胞内硝酸盐水平显著低于对照组，下降30%以上(图4，*P < 0.05，林P < 0.01，n=5_6)，提示唾液腺细胞摄取硝酸盐能力受到抑制。
[0077]实验例5Sialin基因突变与硝酸盐转运功能研究实验
[0078]Sialin蛋白由495个氨基酸组成,拥有12个跨膜结构,氨基端(N端)和羧基端(C端)位于细胞浆侧。SLC17A5的突变会导致两种主要的唾液酸储存病:快速进展型的婴儿唾液酸储存病(infantile sialic acid storage disease, ISSD)和进展缓慢的成人型(Salla disease，SD)。sialinH183R 突变导致 ISSD，R39C 突变导致 SD。
[0079]1、实验材料和方法
[0080]基本方法同前。sialinH183R和 sialinR39C 质粒由 William A.Gahl 和 ChangyuZheng (NIH, USA)提供。唾液酸储存病患者成纤维细胞由William A.Gahl (NIH, USA)提供。
[0081]2、实验结果
[0082]I) Sialin基因突变与唾液腺细胞(HSG细胞)硝酸盐转运功能
[0083]ISSD和SD疾病突变体转染，5mM硝酸盐(N03_)、唾液酸离子(SA)加载后HSG细胞产生的膜电流较对照组显著下降(#P < 0.01，n=5-15，图5)。症状较轻的突变(SD，R39C)硝酸盐(N03-)、唾液酸离子(SA)膜电流下降约50%;而症状较重的突变(ISSD，sialinH183R)硝酸盐(N03_)、唾液酸离子(SA)膜电流下降约75%。提示唾液酸储存病与机体硝酸盐转运相关。相关体内试验见动物体内实验。[0084]2) Sialin基因突变与成纤维细胞硝酸盐转运功能
[0085]ISSD患者成纤维细胞150mM硝酸盐(N03_)、唾液酸离子(SA)加载后细胞膜电流较正常成纤维细胞显著下降约75% (#P < 0.01，n=4-8,图6)。
[0086]正常成纤维细胞转染sialinH183R后得到了相似的结果，细胞膜电流较正常成纤维细胞显著下降约75% (**P < 0.01，n=4-8，图7)。 [0087]实验例7 Sialin基因突变与硝酸盐转运功能研究体内实验
[0088]1、实验材料和方法
[0089]I)基因转导
[0090]AdCMV-EGFP 腺病毒载体构建参见文献(Zheng C，Baum BJ(2005)Evaluation ofviral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.Mol Therl2 (3):528-536.)。2*10nAdCMV-EGFP、50 μ gsialinH183R 质粒(来源同前)与0.1M 聚乙烯亚胺(PEI，Sigma)混匀，总体积为 3ml。AdCMV-EGFP_sialinH183R-PEI 复合体经腮腺导管口逆行导入小型猪(雄性，5月龄，体重25-30kg)腮腺中(Li J，et al.(2004)Developing a convenient large animal model for gene transfer to salivary glandsin viv0.J Gene Med6(I):55-63 ;Shan Z, et al.(2005)Increased fluid secretionafter adenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1cDNAto irradiatedminiature pig parotid glands.Mol Therll (3):444-451.)。对照为 pAC-luc 质粒和野生型 sialin(WT-sialin)由 Changyu Zheng (NIH, USA)提供。
[0091]2)腮腺液硝酸盐检测
[0092]基因转导三天后给予40mg/kg体重硝酸钾喂食,0.5mg/kg毛果芸香碱肌注后30分钟及60分钟收集腮腺液，方法参见文献(Li J, et al.(2004)Developing aconvenient large animal model for gene transfer to salivary glands in viv0.J Gene Med6(I):55-63 ;Shan Z, et al.(2005)Increased fluid secretion afteradenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1cDNA to irradiatedminiature pig parotid glands.Mol Therll (3):444-451.)? R&D nitrate 试剂盒(R&D 公司)检测腮腺液中硝酸盐浓度。
[0093]3)免疫组化及Western blot检测sialin在腿腺中的表达Sialin抗体购自Abcam公司。
[0094]2、实验结果
[0095]硝酸钾食物加载后30分钟，sialinH183R转染组腮腺液硝酸盐浓度为152.50±49.29μΜ，显著低于对照组 221.63±20.83 μ M (P < 0.05, η=8)。加载 60 分钟后，sialinH183R转染组腮腺液硝酸盐浓度为204.09±83.12 μ M，显著低于对照组305.31±78.83μΜ (P < 0.05，η=8)。免疫组化及 Western blot 验证转染效力，图 8，C 为sialinH183R转染腮腺，D为对照腮腺。
【权利要求】
1.SLC17A5基因在制备治疗体内硝酸盐转运、代谢障碍相关疾病、抗高血压、抗休克、治疗心肌梗死或预防胃溃疡的药物。
2.SLC17A5基因在制备诊断机体内硝酸盐转运或代谢障碍或异常相关的疾病的试剂中的用途。
3.按照权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述SLC17A5基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1 所示。
4.按照权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的与机体内硝酸盐转运或代谢障碍或异常相关的疾病包括唾液腺功能低下、口腔或消化道感染。
5.按照权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的药物为基因治疗药物。
6.SLC17A5基因所编码蛋白在制备治疗体内硝酸盐转运、代谢障碍相关疾病、抗高血压、抗休克、治疗心肌梗死或预防胃溃疡的药物中的用途。
7.按照权利要求6所述的用途，其特征在于:所述蛋白的氨基酸序列为SEQID N0.2所/Jn ο
8.按照权利要求7所述的用途，其特征在于:所述的与机体内硝酸盐转运或代谢障碍或异常相关疾病包括唾液腺功能低下、口腔或消化道感染。
9.一种治疗或诊断与机体内硝酸盐转运或代谢障碍相关的疾病的药物或试剂，其特征在于，包括:SLC17A5基因和药学上可接受的载体。
10.一种治疗或诊断与机体内硝酸盐转运或代谢障碍相关的疾病的药物或试剂，其特征在于，包括:SLC17A5基因所编码 蛋白和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P9/02GK103536932SQ201210237820
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月9日 优先权日:2012年7月9日
【发明者】王松灵, 秦力铮, 刘细保, 邓大君, 英杜·阿伯德卡 申请人:王松灵