专利名称：可用作凝血酶受体调制剂的取代的杂环酰基－三肽的制作方法
技术领域：
本发明背景凝血酶是止血和血栓形成中重要的丝氨酸蛋白酶。凝血酶的重要作用之一是受体激活。发现Coughlin，1991(T.K.Vu，细胞(Cell)1991，64，1057)克隆的功能人凝血酶受体是G-蛋白质偶联受体(GPCR)超家族的一员。据认为N-末端识别和Arg-41/Ser-42肽键处蛋白裂解释放截短的N-末端而发生受体激活。该新的受体序列具有作为识别受体上位点的束缚的配体起作用的SFLLRN(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn)N-末端，其能引发导致血小板凝聚的激活和信号转导。以该六肽为基础的肽类似物也表现出导致血小板凝聚的良好的激动活性。1991年以来，克隆了与凝血酶受体具有高同源性的其它两种蛋白酶-激活的受体，“PAR-2”和“PAR-3”，并且发现它们被类似的N-末端六肽序列激活。因此，凝血酶受体的激动剂/拮抗剂，例如本发明包括的那些，也可以用于对这些蛋白酶-激活的受体的激活/拮抗。
本发明的激动剂化合物对凝血酶受体的激活作用可以模拟凝血酶在组织修复中的作用。凝血酶可以激发与伤口愈合相关的作用，例如提高血管渗透性，使得细胞和液体进入受伤的组织(A.B.Malik，Semin.Thromb.Haemostasis1986，184)；提高了内皮细胞PDGF的合成(J.M.Harlan，细胞生物学杂志(J.CellBiol.)1986，103，1129)；和提高血小板，单核细胞和嗜中性粒细胞与内皮细胞的粘着性(M.P.Bevilacqua，科学(Science)1989，243，1160)。通过使用凝血酶促进手术切除之后大鼠组织修复(D.H.Carney，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)1992，89，1469)。因此，凝血酶受体的激动剂可以用作伤口愈合药物或用于组织修复。
本发明以肽为基础的凝血酶受体拮抗剂通过它们防止血小板凝聚的能力可以表现出抗心肌梗塞，中风，再狭隘，绞痛(angina)，动脉粥样硬化和局部缺血性发作的效果。在其它细胞类型上也鉴定了凝血酶受体内皮，成纤维细胞，骨肉瘤，平滑肌，和神经元/神经胶质。内皮细胞的凝血酶激活正调节P-选择蛋白，诱导多形核白细胞粘着-一种血管壁的炎症反应(Y.Sugama，细胞生物学杂志(J.CellBio1.)1992，119，935)。在成纤维细胞中，凝血酶受体激活诱导增殖和促有丝分裂信号的传递(D.T.Hung，细胞生物学杂志(J.CellBiol.)1992，116，827)。凝血酶通过其成骨细胞的激活而影响成骨细胞增殖(D.N.Tatakis，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun)1991，174，181)。凝血酶与神经元的调节和收缩有关(K.Jalink，细胞生物学杂志(J.CellBiol.)1992，118，411)。因此，在这方面，本发明的拮抗剂化合物也可以用于抗炎症，再狭隘，癌症，骨质疏松和神经变性疾病。
这些化合物是凝血酶受体调制剂，并且可以用作伤口愈合和组织修复中的激动剂或者用作心肌梗塞，中风，再狭隘，绞痛，动脉粥样硬化，局部缺血性发作，炎症，癌症，骨质疏松和神经变性疾病的拮抗剂。本发明的详细描述更具体地，本发明涉及下面式(I)的化合物及其药学可接受盐 其中A1是选自Cha，Leu和Ile的烷基氨基酸残基，选自Arg和Lys的氨基烷基氨基酸残基，或者选自Phe，取代的Phe，Tyr或Trp的芳基氨基酸残基；
A2是选自Lys，Orn，Arg和高Arg的氨基烷基氨基酸残基；A3是选自Phe，取代的Phe，Tyr，Trp，苯基-Gly，2-噻吩基-Ala和3-噻吩基-Ala的芳基氨基酸残基，选自Cha，Leu和Ile的烷基氨基酸残基，选自Asn和Gln的酰氨基烷基氨基酸，或者选自Arg，高Arg，Orn和Lys的氨基烷基氨基酸残基；X选自CO，CS或SO2；Y选自芳基，取代的芳基，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基乙烯基，取代的杂芳基乙烯基，芳基丙烯酰胺基杂芳基，取代的芳基丙烯酰胺基杂芳基，杂芳基丙烯酰胺基杂芳基和取代的杂芳基丙烯酰胺基杂芳基，优选地，Y不是吡咯烷基，取代的吡咯烷基，苯基或2-氨基苯基；最优选地，Y选自杂芳基，取代的杂芳基，芳基丙烯酰胺基杂芳基，和取代的芳基丙烯酰胺基杂芳基；Z选自NH2，NH-烷基，NH-芳烷基，或者选自Arg-NH2的氨基烷基氨基酸残基；和其中所有的氨基酸都是L-构型。
在式(I)的化合物中，包括A1，A2和A3取代基的氨基酸残基连接根据标准命名原则的相邻部分，使得氨基酸的氨基末端(N-末端)位于左侧而氨基酸的羧基末端位于右侧。这样，例如，在化合物1中，其中A1是Cha，A2是Arg和A3是Phe，Cha(A1)的N-末端连接X取代基，并且Cha(A1)的羧基末端连接A2取代基(Arg)的N-末端，类似地，Arg(A2)的N-末端连接A1取代基的羧基-末端，并且Arg(A2)的羧基末端连接A3取代基(Phe)的N-末端，类似地，Phe(A3)的N-末端连接A2取代基的羧基-末端，并且Phe(A3)的羧基末端连接Z取代基。
当一个基团是“被取代的”时(例如Phe，杂环烷基，杂芳基，丙烯酰胺基杂芳基)，该基团可以有1-4个独立地选自下面的取代基卤原子(I，Br，Cl，F)，C1-C8烷基，C1-C8烷氧基，氨基，酰胺基，羧基，氰基，硝基，氟化C1-C8烷基，氟化C1-C8烷氧基，或芳基(优选苯基或取代的苯基)。
这里使用的术语“受治疗者”指动物，优选哺乳动物，最优选人，它们是治疗，观察或实验的对象。
这里使用的术语“治疗有效量”指在研究人员，兽医，医生或其它临床医务人员研究的组织系统，动物或人中引起生物学或医药学反应的活性化合物或药物试剂的量，所述生物学或医药学反应包括要治疗的疾病或失调的症状的减轻。
除非另有说明，这里所使用的烷基和烷氧基，单独使用或者作为取代基团的一部分，包括具有1-8个或者该范围内任何数目碳原子的直链和支链。例如，烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，正-丁基，异丁基，仲-丁基，叔-丁基，正-戊基，3-(2-甲基)丁基，2-戊基，2-甲基丁基，新戊基，正-己基，2-己基和2-甲基戊基。烷氧基是由上文描述的直链或支链烷基形成的氧醚。环烷基包含3-8个成环碳原子，并且优选5-7个碳原子。类似地，链烯基和炔烃基包括具有1-8个或者该范围内任何数目碳原子的直链和支链烯烃和炔烃。
这里使用的术语“芳基”，单独或者与其它术语组合，代表芳烃基团。芳基例子包括但不限于苯基，萘基，菲基，蒽基，亚联苯基(biphenylenyl)，芴基或奥基。优选的芳基包括苯基，萘基和亚联苯基。
这里使用的术语“杂环烷基”代表未取代的或取代的稳定的3-7元单环饱和环系，其由碳原子和1-3个选自N，O或S的杂原子组成，并且其中氮或硫杂原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。在任何杂原子或碳原子处可以连接杂环烷基，这导致产生一种稳定结构。这样的杂环烷基的例子包括但不限于氮杂环丁烷基，哌啶基，哌嗪基，氧代哌嗪基，氧代哌啶基，氧代氮杂环庚三烯基(oxoazepinyl)，环庚三烯基(azepinyl)，四氢呋喃基，二氧戊环基，四氢咪唑基，四氢噁唑基，四氢吡喃基，吗啉基，硫代吗啉基，硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)亚砜，硫杂吗啉基砜和噁二唑基。
这里使用的术语“杂芳基”代表未取代的或取代的稳定的5或6元单环芳香环系或者未取代的或取代的9或10元苯稠合的杂芳香环系，其由碳原子和1-3个选自N，O或S的杂原子组成，并且其中氮或硫杂原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。在任何杂原子或碳原子处可以连接杂芳基，这导致产生一种稳定结构。这样的杂芳基的例子包括但不限于吡啶基，哒嗪基，噻吩基，呋喃基，咪唑基，异噁唑基，噁唑基，吡唑基，吡咯基，噻唑基，噻二唑基，三唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并异噁唑基，苯并噁唑基，苯并吡唑基，吲哚基，苯并噻唑基，苯并噻二唑基，苯并三唑基或喹啉基。优选的杂芳基包括吡啶基，吡咯基，吡嗪基，噻二唑基，吡唑基，噻吩基，三唑基和喹啉基。
术语“芳烷基”指被芳基取代的烷基(例如苄基，苯乙基)。类似地，术语“芳烷氧基”指被芳基取代的烷氧基(例如苄基氧基)。
这里使用的术语“酰基”指通过去除羟基而从有机酸衍生的具有1-6个碳原子的有机基团(支链或直链)。
术语“酰胺基”指基团C(O)NH或C(O)NH2。
术语“羰基”指基团C(O)。
这里使用的术语“芳基丙烯酰胺基杂芳基”指与乙烯基连接的芳基基团，所述乙烯基连接酰胺基，所述酰胺基连接杂芳基，其中术语“芳基”，“酰胺基”和“杂芳基”如上定义。因此术语“芳基丙烯酰胺基杂芳基”可以指例如芳基-C＝C-C(O)-NH-杂芳基这样的基团，这样的“芳基丙烯酰胺基杂芳基”具体的例子是具有下面结构的5-(甲基-肉桂酰胺基)三唑-3-基O。 分子中具体位置处的任何取代基或变项的定义旨在与其在该分子中其它位置的定义是无关的。要理解本领域技术人员可以选择本发明的化合物上取代基和取代型式，以提供化学稳定的并且可以通过本领域公知的技术和这里提供的那些方法容易合成的化合物。
如这里使用的，术语“组合物”意指包括以具体的量含有具体成分的一种产物，以及直接或间接地从具体量的具体成分的组合产生的任何产物。
本发明的化合物还可以以药学可接受盐的形式存在。药学可接受盐一般取其中用无机或有机酸将氨基取代的杂环或氨基酸碱性侧链的氮质子化的形式。代表性有机或无机酸包括盐酸，氢溴酸，氢碘酸，高氯酸，硫酸，硝酸，磷酸，乙酸，丙酸，甘醇酸，乳酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，扁桃酸，甲磺酸，羟基乙磺酸，苯磺酸，草酸，棕榈酸，2-萘磺酸，对-甲苯磺酸，环己烷氨基磺酸，水杨酸，己糖酸或三氟乙酸。
本发明其范围内包括本发明的化合物的前体药物。一般情况下，这样的前体药物是可在体内容易转化为需要化合物的化合物的官能衍生物。因此，在本发明的治疗方法中，术语“施用”应该包括使用具体公开的化合物或者使用没有具体公开的但是对受治疗者施用之后在体内转化为该具体化合物的化合物对所述的各种疾病治疗。例如“前体药物的设计”(Design of Prodrugs)，H.Bundgaard编著，Elsevier，1985中描述了合适的前体药物衍生物的筛选和制备的常规程序。
在根据本发明的化合物具有至少一个手性中心的情况下，它们因而可以以对映异构体存在。在化合物具有两个或多个手性中心的情况下，它们另外可以以非对映异构体存在。要理解本发明范围内包括所有这样的异构体及其混合物。此外，这些化合物的一些晶体形式可以以多晶型物存在，这些都包括在本发明内。另外，一些化合物可以与水形成溶剂化物(即水合物)或与普通的有机溶剂形成溶剂化物。这样的溶剂化物也包括在本发明的范围内。
在本申请人申请本发明之前，已知的凝血酶受体激动剂是具有5个氨基酸最短序列长度的肽(即PAR-1肽激动剂)。申请人出人意料地发现明显截短或者在肽骨架中包含杂环作为肽模拟单位(peptidomimetic unit)的本发明凝血酶受体激动剂。
可以用作凝血酶受体激动剂的本发明特别优选的化合物包括表1中给出的那些化合物，表中给出了血小板凝聚的EC50值和对凝血酶受体的结合IC50。除非另有说明，氨基酸具有“L”绝对构型。
表1
1. 50M下诱导的凝聚百分比.
可以用作凝血酶受体拮抗剂或混合的激动剂/拮抗剂的本发明特别优选的化合物包括表2给出的那些，表2给出了抑制血小板凝聚(凝血酶诱导的凝胶-过滤的血小板凝聚)的IC50值和对凝血酶受体的结合IC50值。除非另有说明，氨基酸具有“L”绝对构型。
表2
特别优选的本发明化合物是(5-溴吡啶-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；2-色酮基羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(5-氨基三唑-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[5-(甲基)肉桂酰胺基三唑-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；{5-[3-(1-萘基)丙烯酰胺基]三唑-3-基}羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[喹喔啉-2-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[5-(邻-氯肉桂酰胺基)三唑-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(6-氨基吡啶-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(5-氨基三唑-3-基)羰基-苯丙氨酰基-精氨酰基-苯基丙氨酰基-精氨酸酰胺；(5-氨基三唑-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-赖氨酰基-苯丙氨酸酰胺；{5-[3-(2-噻吩基)丙烯酰胺基]三唑-3-基}羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[5-肉桂酰胺基三唑-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(6-肉桂酰胺基吡啶-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；或(5-氯-3-甲基-苯并噻吩-2-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；和它们药学可接受盐。
可以使用如图示A说明的固相化学方法制备本发明的调制剂。
图示A 因此，在合适的溶剂例如DMF中用哌啶或任何二烷基胺通过搅拌将树脂Fmoc去保护，用新鲜溶剂洗涤后使用合适的偶联剂例如二异丙基碳化二亚胺(DIC)或二环己基碳化二亚胺(DCC)或二(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-C1)和羟基苯并三唑(HOBT)一起在DMF或其它偶极非质子溶剂中与Fmoc保护的氨基酸A3偶联。洗涤后，在DMF中用二烷基胺将载有氨基酸的树脂如上所述Fmoc去保护，并且使用上面的偶联剂再次与第二个Fmoc保护的氨基酸A2偶联。在DMF中，或者在合适的溶剂中，进一步用二烷基胺将该载有Fmoc二肽的树脂去保护，并且使用上面的偶联剂再次与Fmoc氨基酸A1偶联。在DMF中，用二烷基胺将三肽树脂去保护，并且使用合适的偶联剂与被取代的酸Y-X-OH偶联。此时可以在任何惰性溶剂例如DCM中使用强酸例如三氟乙酸(TFA)将产物从树脂上裂解下来，得到肽酰胺1。但是，如果Y基团具有保护的氨基官能度，例如Fmoc-氨基，这可以去保护，并且从该树脂上裂解下来的氨基-肽产物或者游离的胺可以在肽从树脂上裂解下来之前进一步反应。因此，如上所述，在DMF中用二烷基胺去除Fmoc，而氨基-肽可以1)用TFA从树脂上裂解或者2)使用合适的偶联剂例如BOP-Cl与芳基丙烯酸偶联，用TFA将产物从树脂上裂解得到肽II。根据该一般途径，按图示1中的描述制备化合物1，这在实验部分有更详细地描述。
图示1 或者，可以通过如图示B所示的常规液相化学方法制备化合物。
图示B 因此，在偶极非质子溶剂例如乙腈(ACN)或二甲基甲酰胺(DMF)中使用常规肽偶联剂例如DIC或DCC和HOBT可以将Fmoc保护的氨基酸A3与胺ZH偶联。然后，在偶极非质子溶剂例如ACN中可以使用二乙胺(DEA)或者其它二烷基胺将分离的产物Fmoc去保护，并且产物胺与第二个Fmoc保护的氨基酸A2偶联。类似地，该二肽可以如上所述去保护，并且用合适的偶联剂与Fmoc保护的氨基酸A1偶联，得到Fmoc-三肽。使用二烷基胺将Fmoc基团去保护，接着通过使用偶联剂例如DIC和HOBT通过该三肽与酸Y-X-OH偶联得到产物III。利用该常规途径，根据图示2中的描述合成化合物2，这在实验部分有进一步描述。
图示2 根据这里实施例4和5中描述的方法可以测定式(I)化合物作为凝血酶受体调制剂的效用。因此本发明提供对需要治疗凝血酶受体调制介导的疾病的受治疗者治疗凝血酶受体的调制介导的病症的方法，包括以有效治疗该病症的量施用这里定义的任何化合物或药物组合物。另外，本发明包括式(I)化合物用于制备治疗凝血酶受体调制介导的病症的药物的用途。可以通过任何常规给药途径给受治疗者施用该化合物，所述给药途径包括但不限于静脉内，口服，皮下，肌内，真皮内和肠胃外。
本发明还提供含有一种或多种本发明的化合物和药学可接受载体的药物组合物。
为了制备本发明的药物组合物，根据常规药物配制技术，首先将作为活性成分的一种或多种本发明的式(I)的化合物或者其盐与药学可接受载体混合，载体可以是各种各样的形式，取决于给药例如口服或肠胃外，例如肌内给药期望的制剂形式。在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何常规药物介质。因此，对于液体口服制剂，例如悬浮剂，酏剂和溶液，合适的载体和添加剂包括水，二醇类，油类，醇类，矫味剂，防腐剂，着色剂等等；对于固体口服制剂，例如粉末剂，胶囊，caplets，gelcaps和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉，糖，稀释剂，造粒剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂等等。由于容易给药，片剂和胶囊是最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然使用固体药物载体。如果期望，可以通过标准技术将片剂包糖衣或包肠溶衣。对于肠胃外给药，载体通常包括灭菌水，可以包括其它成分，例如为了助溶或者为了防腐的目的。也可以制备可注射悬浮剂，在这种情况下，可以使用合适的液体载体，悬浮剂等等。药物组合物每剂量单位例如片剂，胶囊，粉末剂，注射剂，茶匙等含有如上所述输送有效剂量所需要的活性成分的量。药物组合物每剂量单位例如片剂，胶囊，注射剂，粉末剂，栓剂，茶匙等含有大约0.03毫克至100毫克/千克(优选0.1-30毫克/千克)，并且可以以大约0.1-300毫克/千克/天(优选1-50毫克/千克/天)的剂量给药。但是这些剂量可以根据受治疗者的需要，治疗的疾病的严重程度和使用的化合物而变化。可以每天给药或者后周期剂量(post-periodic dosing)给药。
这些组合物优选是单位剂量形式，选自例如片剂，丸剂，胶囊，粉末剂，颗粒剂，无菌肠胃外溶液或悬浮剂，剂量气雾剂或液体喷雾剂，滴剂，安瓿，自动注射器装置或栓剂；用于口服。肠胃外，鼻内，舌下或直肠给药，或者用于通过吸入或吹入给药。或者，组合物可以以适合一周一次或一月一次给药的形式存在；例如，可以采用活性化合物的不溶性盐例如癸酸盐来提供用于肌内注射的储存型制剂(depotpreparation)。对于制备固体组合物，例如片剂，将主要活性成分与药物载体例如常规制片剂成分，例如玉米淀粉，乳糖，蔗糖，山梨糖醇，滑石，硬脂酸，硬脂酸镁，磷酸二钙或树胶，和其它药物稀释剂，例如水混合，来形成含有本发明的化合物或者其药学可接受盐的均匀混合物的固体制剂前组合物。当指这些制剂前组合物为均匀的时，指活性成分均匀分布于组合物中，这样组合物可以容易地分为等有效剂量形式，例如片剂，丸剂和胶囊。然后将固体制剂前组合物分为含有0.1至大约500毫克本发明活性成分的上述类型的单位剂量形式。可以将新的组合物的片剂或丸剂包衣或者复合以提供具有延长作用优点的剂量形式。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量组分，后者是包被前者的形式。这两种组分可以由肠溶层隔开，肠溶层防止在胃中崩解并且允许内组分完整穿过进入十二指肠或者延迟释放。多种材料可以用于肠溶层或包衣，这样的材料包括多种高分子酸与例如紫胶，十六烷醇和乙酸纤维素这样的材料。
可以掺入本发明新的组合物用于口服或通过注射给药的液体形式包括水溶液，适当调味的糖浆，水性或油性悬浮液和有食用油的调味乳状液，所述食用油是例如棉花籽油，芝麻油，椰子油或花生油，以及酏剂和类似的药物赋形剂。用于水悬浮液的合适的分散剂或悬浮剂包括合成的和天然的树胶，例如黄耆胶，阿拉伯树胶，藻酸盐，葡聚糖，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
用于制备本发明化合物的方法给出立体异构体混合物的情况下，可以通过常规技术例如制备色谱来分离这些异构体。可以制备外消旋形式的化合物，或者通过对映体特异性合成或者通过拆分可以制备各对映体。例如，通过标准技术，例如通过与光学活性酸例如(-)-二-对-甲苯酰基-d-酒石酸和/或(+)-二-对-甲苯酰基-1-酒石酸成盐而形成非对映对，接着分级结晶并且再生成游离碱，可以将化合物拆分为它们的对映体成分。通过形成非对映酯或酰胺，接着色谱分离并且去除手性助剂，也可以拆分化合物。或者可以使用手性HPLC柱拆分化合物。
在制备本发明化合物的方法中，可能需要和/或期望保护涉及的分子上的敏感或反应基团。这可以使用常规保护基团进行保护，所述保护基团有例如，有机化学中的保护基团(Protective Groups inOrganic Chemistry)，J.F.W.McOmie编著，Plenum Press，1973；和T.W.Greene和P.G.M.Wuts，有机合成中的保护基团(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)，John Wliey & Sons，1991中描述的那些。使用本领域公知的方法在适当的后续阶段可以去除保护基团。
使用含有如上所述任何化合物和药学可接受载体的药物组合物也可以实施治疗本发明描述的凝血酶受体调制介导的疾病的方法。药物组合物可以含有大约0.01毫克至100毫克，优选大约5毫克至50毫克的化合物，并且可以配制成适合所选择的给药方式的任何形式。载体包括必要的和惰性药物赋形剂，包括但不限于粘合剂，悬浮剂，润滑剂，矫味剂，甜味剂，防腐剂，染料和包衣。适合口服给药的组合物包括固体形式，例如丸剂，片剂，caplet，胶囊(各包括立刻释放，定时释放和延迟释放制剂)，颗粒剂和粉末剂，和液体形式，例如溶液，糖浆，酏剂，乳状液和悬浮液。可用于肠胃外给药的形式包括灭菌溶液，乳状液和悬浮液。
有利地，本发明化合物可以以单一日剂量给药，或者总日剂量可以每天分两次，三次或四次剂量给药。此外，本发明的化合物可以通过局部使用的合适的鼻内赋形剂以鼻内形式给药，或者通过本领域技术人员公知的透皮贴给药。为了以经皮输送体系形式给药，剂量给药当然在给药方案中是连续的而不是间断的。
例如，对于片剂或胶囊形式的口服给药，活性药物成分可以与口服的无毒的药学可接受惰性载体混合，所述载体是例如乙醇，甘油，水等。此外，期望或需要时，也可以向混合物中掺入合适的粘合剂；润滑剂，崩解剂和着色剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉，明胶，天然糖类，例如葡萄糖或β-乳糖，玉米增甜剂，天然和合成树胶，例如阿拉伯树胶，黄耆胶或油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，黄原胶等。
在适当矫味的悬浮或分散剂例如合成的和天然的树胶中形成液体，所述树胶是例如黄耆胶，阿拉伯树胶，甲基纤维素等。对于肠胃外给药，期望灭菌悬浮液和溶液。当期望静脉内给药时，使用一般含有合适的防腐剂的等渗制剂。
本发明的化合物也可以以脂质体输送系统的形式给药，例如小单层脂质体，大单层脂质体，和多层脂质体。也可以从各种磷脂，例如胆固醇，硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成脂质体。
通过使用单克隆抗体作为化合物分子与之偶联的各载体也可以输送本发明的化合物。本发明的化合物也可以与作为定向药物载体的可溶性聚合物偶联。这样的聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚，聚羟基乙基天冬酰胺苯酚，或棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以与一类可用于实现药物的受控释放的生物可降解聚合物偶联，这类聚合物例如聚乳酸，聚ε己酸内酯，聚羟基butyeric acid，聚原酸酯，聚缩醛，聚二羟基吡喃，聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联共聚物或两亲性嵌段共聚物。
当需要治疗血栓形成疾病时，可以用任何上述组合物并且根据本领域确立的给药方案施用本发明的化合物。
每个成人，药物的日剂量可以在0.01-1000毫克宽范围内变化。对于口服，优选以含有0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100，150，200，250和500毫克活性成分的片剂形式提供组合物，用于对要治疗的受治疗者根据症状判断剂量。一般以每天大约0.1毫克/千克体重至大约300毫克/千克体重的剂量水平提供有效量的药物。优选地，该范围是每天大约1毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重。该化合物可以每天1～4次给药。
本领域技术人员可以容易地确定给药的最佳剂量，并且随着使用的具体化合物，给药方式，制剂浓度和疾病症状的发展而改变。另外，与治疗的具体受治疗者相关的因素，包括受治疗者年龄，体重，饮食和给药时间将导致对调节剂量的需要。
为了制备本发明的药物组合物，根据常规药物配制技术，首先将作为活性成分的一种或多种式(I)的化合物或其盐与药物载体混合，载体可以是多种形式，取决于期望施用的制剂的形式，例如口服或肠胃外，例如肌内。在制备口服剂量形式的组合物中，可以使用任何常规制药介质。因此，对于液体口服制剂，例如悬浮液，酏剂和溶液，合适的载体和添加剂包括水，二元醇，油类，醇类，矫味剂，防腐剂，着色剂等；对于固体口服制剂，例如粉末剂，胶囊，caplets，gelcaps，和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉，糖类，稀释剂，造粒剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂等等。由于容易给药，片剂和胶囊是最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然使用固体药物载体。如果期望，可以通过标准技术将片剂包糖衣或包肠溶衣。对于肠胃外给药，载体通常包括灭菌水，可以包括其它成分，例如为了助溶或者为了防腐的目的。也可以制备可注射悬浮剂，在这种情况下，可以使用合适的液体载体，悬浮剂等等。药物组合物每剂量单位例如片剂，胶囊，粉末剂，注射剂，茶匙等含有如上所述输送有效剂量所需要的活性成分的量。药物组合物每剂量单位例如片剂，胶囊，粉末剂，注射液，栓剂，茶匙等含有大约0.03毫克至100毫克/千克(优选0.1-30毫克/千克)，并且可以以大约0.1-300毫克/千克/天(优选1-50毫克/千克/天)的剂量给药。但是这些剂量可以根据受治疗者的需要，治疗的疾病的严重程度和使用的化合物而变化。可以每天给药或者后周期剂量给药。
给出下面的实施例有助于理解本发明，而不是为了并且不应该认为在任何方面限制下面权利要求书中提出的本发明。
从Novabiochem，Synthetech或Bachem Bioscience Inc购得保护的氨基酸。所有其它化学品从Aldrich Chemical Company，Inc.购得。在Bruker AC-300光谱仪上在300MHz下记录高场1H NMR光谱，并且以Herz给出偶合常数。在Robertson MicrolitLaboratories，Inc.，Madison，New Jersey进行微量分析。在实施例以及本申请中，下面的缩写具有下面给出的意义ACN 乙腈BOP-Cl 二(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯DCM 二氯甲烷DCC 二环己基碳化二亚胺DIC 二异丙基碳化二亚胺DEA 二乙胺DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMF N，N-二甲基甲酰胺Et2O二乙基醚Fmoc 芴基甲氧羰基HOBT 羟基苯并三唑Me 甲基Ph 苯基Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基RT 室温TFA 三氟乙酸氨基酸缩写如下定义Arg 精氨酸Asn 天冬酰胺Cha 环己基丙氨酸Gln 谷氨酰胺hArg 高精氨酸hPhe 高苯丙氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Orn 鸟氨酸Phe 苯丙氨酸Phgly苯基甘氨酸2-Thala 2-噻吩基丙氨酸3-Thala 3-噻吩基丙氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸实施例1N-(5-氨基-1，2，4-三唑-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺(1) 将Rink酰胺树脂(4.0g，3.24mm)和20％哌啶/DMF(25ml)置于固相小时-玻璃反应器中并且搅拌(氮气鼓泡)反应1小时。排出溶液，并且用DMF(4X)，DCM(3X)和DMF(3X)洗涤树脂。该树脂与Fmoc-Phe-OH(3.77g，9.75mm)，HOBT(1.5g，9.75mm)和DIC(1.23g，9.75mm)在DMF(25ml)中混合，并且在环境温度下在反应器中搅拌16小时。排出溶液，并且用DMF(5X)和DCM(4X)洗涤树脂并真空干燥。环境温度下将一部分(1.0g，0.80mm)在反应器中与20％哌啶/DMF(15ml)搅拌1小时，排出溶液，并且用DMF(4X)，DCM(3X)和DMF(3X)洗涤树脂。该产物与Fmoc-Arg(Pmc)-OH(1.84g，2.4mm)，HOBT(0.37g，2.4mm)和DIC(0.31g，2.4mm)在DMF(10ml)中混合，并且在环境温度搅拌16小时。排出溶液后，用DMF(4X)和DCM(3X)洗涤树脂。用DMF(3X)洗涤该批产物的一半，然后用20％哌啶/DMF(10ml)搅拌1小时。排出溶液，并且用DMF(4X)，DCM(3X)和DMF(3X)洗涤树脂，然后与Fmoc-Cha-OH(0.47g，1.2mm)，HOBT(0.18g，1.2mm)和DIC(0.15g，1.2mm)在DMF(10ml)中混合，并且在环境温度搅拌16小时。排出溶液，用DMF(4X)，DCM(3X)和DMF(3X)洗涤树脂，并且用20％哌啶/DMF处理1小时。排出溶液，并且用DMF(4X)洗涤树脂，然后与Fmoc-3-氨基-1，2，4-三唑-5-羧酸(0.42g，1.2mm)，HOBT(0.18g，1.2mm)和DIC(0.15g，1.2mm)在DMF(10ml)中混合，并且在环境温度搅拌16小时。排出溶液，用DMF(4X)，DCM(3X)和DMF(3X)洗涤树脂，然后用20％哌啶/DMF(15ml)搅拌1小时。排出溶液，用DMF(4X)和DCM(3X)洗涤树脂，并将树脂在氮气下干燥。然后在环境温度将树脂用99％TFA(20ml)搅拌1.5小时。收集TFA溶液并且真空蒸发得到油状物，将其用Et2O(3X)研制，得到白色固体(152mg)。
使用0.16％TFA的ACN溶液/0.20％TFA的水溶液(35∶65)通过反相HPLC进行纯化，冻干，得到白色絮状固体1(120mg)。C27H41N11O4·2.25TFA·1.0H2O(858.26)的分析计算值C，44.08；H，5.13；N，17.95；F，14.94.FoundC，43.82；H，5.27；N，17.91；F，14.50. FAB-MSm/e 584.9(MH+).1H NMR(DMSO/D2O)7.25(m，5H)，4.5(dd，1H)，4.4(dd，1H)，4.28(dd，1H)，3.1-2.95(m，3H)，2.8(dd，1H)，1.8-1.35(m，11H)，1.3-1.0(m，4H)，0.9(m.2H).
实施例2N-(5-溴吡啶-3-基-羰基)-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺(2) Fmoc-苯丙氨酸酰胺(3.87g，10mm)在ACN(100ml)中搅拌并且加入DEA(5ml)，并且在RT下搅拌1小时。真空蒸发溶液得到油状物，将其用己烷(100ml)研制3次，并且溶解于ACN(100ml)；加入Fmoc-Arg(PMC)-OH(6.63g，10mm)和HOBT(1.53g，10mm)，接着加入DCC(4.1g，20mm)，并且将该溶液在RT下搅拌。过滤脲副产物，真空蒸发滤液得到油状物，将其用己烷(100ml)研制3次。粗产物在ACN(100ml)中搅拌并且加入DEA(5ml)，并且在RT下搅拌1小时。真空蒸发溶液得到油状物，将其用己烷(100ml)研制3次得到固体。该二肽在ACN(100ml)中与Fmoc-Cha-OH(3.93g，10mm)和HOBT(1.53g，10mm)混合，接着加入DIC(2.52g，20mm)，该反应在RT下搅拌16小时。过滤固体三肽；还可通过蒸发和硅胶柱色谱从滤液中回收三肽。三肽(5.0g，5mm)在含有DEA(5ml)的ACN(100ml)中搅拌直到去保护完全，然后真空蒸发并且用己烷(100ml)研制3X。将其在ACN(100ml)和5-溴烟酸(1.01g，5mm)中混合并且加入HOBT(0.76g，5mm)，接着加入DIC(1.26g，10mm)，并且在RT下搅拌16小时。真空蒸发溶液并且通过硅胶柱色谱纯化。然后该保护的产物用DCM/TFA(1∶1；50ml)搅拌1小时，然后真空蒸发得到油状物，将其用Et2O(100ml)研制三次，得到白色固体3，为三氟乙酸盐MSm/e657.4/659.4(MH+)。
1H NMR(DMSO)9.0(s，1H)，8.9(s，1H)，8.8(d，1H)，8.5(s，1H)，8.2(d，1H)，7.8(d，1H)，7.4(s，2H)，7.1-7.3(m，6H)，4.5(m，2H)，4.2(q，1H)，4.0(s，1H)，3.0(m，1H)，2.8(q，1H)，1.3-1.8(m，12H)，1.1(m，4H)，0.9(m，3H).
实施例3作为口服组合物的具体实施方案，将100毫克实施例1的化合物1与足够细碎的乳糖一起配制，得到580-590毫克的总量，装入到O号硬凝胶胶囊中。生物学本发明的化合物能调制由血小板表面受体的凝血酶酶解诱导的血小板激活，从而激活/抑制血小板凝聚。表现出激动剂活性的化合物可以预期有助于伤口愈合和组织修复，而拮抗剂化合物可以用于治疗血小板-介导的血栓形成疾病，例如动脉和静脉血栓形成，急性心肌梗塞，溶解血栓治疗和血管成形术之后的再闭塞，和各种各样的血管栓塞疾病。
实施例4体外凝血酶受体结合测试自-70℃解冻CHRF膜(Jones，生物化学生物物理年鉴(Biochim.Biophys.Acta)1992，1136，272)，以最大速度离心5分钟，用结合缓冲液(含有5m M氯化镁和0.1％BSA的50mM HEPES)洗涤两次，再次悬浮于结合缓冲液(25g/100ml)。将100 l膜加入到24-孔板中，并且送至Tomtech仪器。在典型的实验中，将6 l样品(自125g/ml中间板，20％DMSO)和44 l缓冲液供至平板(化合物的终浓度是3.7g/ml，0.6％DMSO)。类似地，将6 l 20％DMSO和44 l缓冲液送至柱1(NSB)和柱12(TB)。向柱1加10 l Ser-pFPhe-Har-Leu-Har-Lys-Tyr-NH2(721-40；500M，于去离子水中)。向所有的孔加50 l氚化721-40(特异活性46Ci/mmol)。使平板充分混合20秒，孵育30分钟，然后使用Skatron收获器用10mM HEPES/138mM氯化钠收集。在莎伦包装膜中放置过滤器(GF/C Brandel FPXLR 296过滤器在HEPES/0.1MN-乙酰基葡糖胺中0.5％聚氮丙啶中预浸渍3小时)，并且在微波炉中干燥3分钟，并且放在样品袋(Wallac1450-432)中。加入4.5ml闪烁液(Wallac Betaplate Scint 1205-440)。将袋子密封，置于过滤器盒(Wallac1450-104)中，并且在β微计数器(microbeta counter)上分析。
实施例5体外激动剂血小板凝聚测试/凝血酶诱导的凝胶-过滤的血小板凝聚的抑制测试以化合物处理的血小板浓缩物对对照物处理的血小板浓缩物的透光度的增加来计算血小板凝聚百分比。将从没有服药的正常给体获得的人血液，放入含有0.13M柠檬酸钠的试管中。通过在25℃下将全血以200xg离心10分钟收集富集血小板的血浆(PRP)。将该PRP(5ml)通过Sepharose2B(床体积50ml)凝胶过滤，并且将血小板数调节到每个样品2×107个血小板。向硅化比色杯加入下面的成分浓缩的血小板过滤液和量等于350 l的Tyrode氏缓冲液(0.14M氯化钠，0.0027M氯化钾，0.012M碳酸氢钠，0.76mM磷酸氢二钠，0.0055M葡萄糖，2mg/mlBSA和5.0mM HEPES@pH7.4)，50 l 20mM钙和50 l试验化合物。加入激动剂(50 l 1单位/ml的凝血酶)后在BIODATA凝聚器中监测凝聚作用3分钟。
尽管上述具体说明教导了本发明的原理，提供实施例是为了举例说明的目的，但应当懂得本发明的实施包括所有的通常的改变，适应和/或修饰，这些都在下面的权利要求书和它们的等同物的范围内。
权利要求
1.下面通式(I)表示的化合物及它们的药学可接受盐 其中A1是选自Cha，Leu和Ile的烷基氨基酸残基，选自Arg和Lys的氨基烷基氨基酸残基，或者选自Phe，取代的Phe，Tyr或Trp的芳基氨基酸残基；A2是选自Lys，Orn，Arg和高Arg的氨基烷基氨基酸残基；A3是选自Phe，取代的Phe，高Phe，Tyr，Trp，phgly，2-Thala和3-Thala的芳基氨基酸残基，选自Cha，Leu和Ile的烷基氨基酸残基，选自Asn和Gln的酰氨基烷基氨基酸，或者选自Arg，高Arg，Orn和Lys的氨基烷基氨基酸残基；X选自CO，CS或SO2；Y选自芳基，取代的芳基，杂环烷基，取代的杂环烷基，杂芳基，取代的杂芳基，杂芳基乙烯基，取代的杂芳基乙烯基，芳基丙烯酰胺基杂芳基，取代的芳基丙烯酰胺基杂芳基，杂芳基丙烯酰胺基杂芳基和取代的杂芳基丙烯酰胺基杂芳基，前提是，Y不是吡咯烷基，苯基或2-氨基苯基；Z选自NH2，NH-烷基，NH-芳烷基，或者选自Arg-NH2的氨基烷基氨基酸残基；和其中所有的氨基酸都是L-构型。
2.权利要求1的化合物及其药学可接受盐，其中A3是选自Phe，取代的Phe，Tyr，Trp，phgly，2-Thala和3-Thala的芳基氨基酸残基，选自Cha，Leu和Ile的烷基氨基酸残基，选自Asn和Gln的酰氨基烷基氨基酸，或者选自Arg，高Arg，Orn和Lys的氨基烷基氨基酸残基；Y选自杂芳基，取代的杂芳基，芳基丙烯酰胺基杂芳基和取代的芳基丙烯酰胺基杂芳基。
3.权利要求2的化合物及其药学可接受盐，其中A1是选自Cha，Leu和Ile的烷基氨基酸残基，或者选自Phe，取代的Phe，Tyr或Trp的芳基氨基酸残基；A2是选自Lys或Arg的氨基烷基氨基酸残基；A3是选自Phe，取代的Phe，Tyr，Trp，phgly和2-Thala的芳基氨基酸残基；X选自CO或SO2。
4.权利要求3的化合物及其药学可接受盐，其中X是CO；Y选自苯并噻吩基(benzothiophenyl)，取代的苯并噻吩基，吡啶基，取代的吡啶基，三唑基，取代的三唑基，色酮基，喹喔啉基，噻二唑基，取代的噻二唑基，吡嗪基，取代的吡嗪基，吡啶基乙烯基，取代的吡啶基乙烯基，肉桂酰胺基-三唑基，取代的肉桂酰胺基-三唑基，噻吩基(thiophenyl)丙烯酰胺基-三唑基或萘基丙烯酰胺基-三唑基；Z选自NH2或Arg-NH2。
5.权利要求4的化合物及其药学可接受盐，其中A1选自Cha或Phe；A2选自Arg或Lys；A3选自Phe。
6.权利要求5的化合物及其药学可接受盐，选自(5-溴吡啶-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；2-色酮基羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(5-氨基三唑-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[5-(-甲基)肉桂酰胺基三唑-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；{5-[3-(1-萘基)丙烯酰胺基]三唑-3-基}羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[喹喔啉-2-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[5-(邻-氯肉桂酰胺基)三唑-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(6-氨基吡啶-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(5-氨基三唑-3-基)羰基-苯丙氨酰基-精氨酰基-苯基丙氨酰基-精氨酸酰胺；(5-氨基三唑-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-赖氨酰基-苯丙氨酸酰胺；{5-[3-(2-噻吩基)丙烯酰胺基]三唑-3-基}羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；[5-肉桂酰胺基三唑-3-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；(6-肉桂酰胺基吡啶-3-基)羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺；或(5-氯-3-甲基-苯并噻吩-2-基]羰基-环己基丙氨酰基-精氨酰基-苯丙氨酸酰胺。
7.含有药学可接受载体和权利要求1的化合物的药物组合物。
8.通过将权利要求1的化合物与药学可接受载体混合制备的药物组合物。
9.制备药物组合物的方法，包括将权利要求1的化合物与药学可接受载体混合。
10.对需要治疗凝血酶受体的调制介导的疾病的受治疗者进行治疗的方法，包括对受治疗者施用治疗有效量的权利要求1的化合物。
11.权利要求10的方法，其中所述疾病选自伤口愈合，组织修复，心肌梗塞，中风，再狭隘，绞痛，动脉粥样硬化，局部缺血性发作，炎症，癌症，骨质疏松和神经变性疾病。
12.权利要求11的方法，其中化合物的治疗有效量是大约0.1至大约300mg/kg/天。
13.权利要求12的方法，其中化合物的治疗有效量是大约1至大约50mg/kg/天。
14.对需要治疗凝血酶受体调制的疾病的受治疗者进行治疗的方法，包括对受治疗者施用治疗有效量的权利要求7的组合物。
15.权利要求14的方法，其中所述疾病选自伤口愈合，组织修复，心肌梗塞，中风，再狭隘，绞痛，动脉粥样硬化，局部缺血性发作，炎症，癌症，骨质疏松和神经变性疾病。
16.权利要求14的方法，其中化合物的治疗有效量是大约0.1至大约300mg/kg/天。
17.权利要求16的方法，其中化合物的治疗有效量是大约1至大约50mg/kg/天。
全文摘要
本发明涉及可用作凝血酶受体调制剂的取代的杂环酰基－三肽,它们在伤口愈合和防止血小板凝聚中的用途。也公开了含有本发明的取代的杂环酰基－三肽的药物组合物和治疗凝血酶受体介导的疾病的方法。
文档编号A61K38/00GK1342164SQ99816184
公开日2002年3月27日 申请日期1999年11月19日 优先权日1998年12月14日
发明者D·F·麦科西, B·E·马亚诺夫, M·J·豪金斯 申请人:奥索-麦克尼尔药品公司