一步通过细胞计数方法研究了雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721和HepG2的细胞生长曲线的影响。细胞生长曲线是判断细胞活力的重要指标。结果显示，随着17β-雌二醇(E2)浓度的升高，肝细胞肝癌细胞SMMC7721和!fepG2的生长速率明显下降。在17 β-雌二醇5 μ M和10 μ M组，在培养的第2天和第3天，细胞数有增加，但从第4天开始细胞逐渐减少，到第7天时两组的细胞几乎全部死亡(见图2中B部分)。
[0026]图2中:Α:雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721 (Al)和H印G2 (Α2)克隆形成能力的影响。Top panel:细胞克隆形成能力的代表性的图。Bottom panel:各组之间克隆形成数量的比较。17β-雌二醇(E2)剂量依赖地抑制了 SMMC7721和H印G2细胞的克隆形成能力。在5μΜ和ΙΟμΜ组，SMMC7721和H印G2细胞均没有克隆的形成。B:雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721 (BI)和H印G2 (Β2)生长曲线的影响。17 β -雌二醇(Ε2)剂量依赖地抑制了 SMMC7721和H印G2细胞的生长速率。在5 μ M和10 μ M组，在培养第7天时，SMMC7721和H印G2细胞均全部死亡。在每一系列中，η = 6。与对照组相比，#Ρ>0.05，**Ρ〈0.01。
[0027]实验例3:雌激素对肝细胞肝癌细胞体内生长的影响:为了观察雌激素对人的肝细胞肝癌细胞体内生长的影响。我们用裸鼠建立肝细胞肝癌的肝脏内原位移植模型。先将人的肝细胞肝癌细胞H印G2接种于裸鼠背部的皮下，待肿瘤生长到Icm大小时，将肿瘤组织剪成Ixlxlmm3小块，进行裸鼠肝脏内原位移植。在原位移植后I周，将裸鼠随机分为对照组以及17 β -雌二醇2.5mg、5mg、10mg和25mg组,每组系列8只裸鼠。将17 β-雌二醇对照丸(不含17 3-雌二醇)以及17 3-雌二醇2.5!^、5mg、1mg 和 25mg 丸(购自美国 Innovative Research of America,均为 30 天释放)放置于裸鼠颈部皮下，15天后处死裸鼠，测量肝脏内肿瘤组织的大小，并取肿瘤组织用免疫组织化学的方法检测细胞增殖标志物Ki67和细胞增殖抗原(PCNA)的表达。K1-67是在增殖细胞中表达的一种核抗原，与细胞增殖密切相关，Κ?67抗原的表达可以反映肿瘤细胞的增殖活性，是检测肿瘤细胞增殖活性的可靠指标。而PCNA是合成真核细胞DNA的一种必需核蛋白，仅在增殖细胞中表达。PCNA以DNA聚合酶δ的辅助蛋白的身份直接参与了 DNA的合成，其表达与细胞周期相关，是评价细胞增殖活性的生物学指标。我们的结果显示17 β -雌二醇呈剂量依赖地抑制了肝细胞肝癌细胞H印G2在肝脏内的生长，抑制了 Ki67和PCNA在肝细胞肝癌细胞H印G2的表达(见图3)。
[0028]图3中:A:雌激素对肝细胞肝癌细胞IfepG2肝内生长的影响。a、b、c、d、e分别是对照组、2.5mg、5mg、10mg、25mg组的代表性的图。17 β -雌二醇呈剂量依赖地抑制了 H印G2细胞在肝脏内的生长。B:雌激素对ItepG2细胞肿瘤组织内Ki67表达的影响。a、b、c、d、e分别是对照组、2.5mg、5mg、10mg、25mg组的代表性的图。f是免疫组化的阴性对照。17 β -雌二醇呈剂量依赖地抑制了肿瘤组织内Ki67的表达。C:雌激素对H印G2细胞肿瘤组织内PCNA表达的影响。a、b、c、d、e分别是对照组、2.5mg、5mg、10mg、25mg组的代表性的图。f是免疫组化的阴性对照。17 β-雌二醇呈剂量依赖地抑制了肿瘤组织内PCNA的表达。在每一系列中η = 8。与对照组相比，**Ρ〈0.01。
[0029]实验例4:雌激素对小鼠肝细胞肝癌发生的影响:
为了进一步研究雌激素对肝细胞肝癌发生的影响，我们应用C57BL6小鼠，用二甲硝胺(diethylnitrosamine)和四氯化碳建立化学诱导的肝细胞肝癌动物模型,在建立模型后4月，将小鼠随机分为对照组以及17 β -雌二醇5mg、10mg、25mg和50mg组,每组系列20只小鼠。将17 β -雌二醇对照丸(不含17 β -雌二醇)以及17 β -雌二醇5mg、10mg、25mg和50mg丸(购自美国Innovative Research of America,均为60天释放)放置于小鼠颈部皮下，于给药后60天，处死小鼠，检查小鼠肝脏内肿瘤的发生情况。结果显示在对照组有16只小鼠的肝脏内发生了肿瘤，且瘤体较大。而在17 β -雌二醇5mg、10mg、25mg和50mg组,分别只有5只、3只、2只和2只小鼠发生了肿瘤，且瘤体较小(见图4)。
[0030]图4中:a、b、C、d、e分别是对照组、2.5mg、5mg、10mg、25mg组的代表性的图。17 β-雌二醇呈剂量依赖地抑制了小鼠肝细胞肝癌的发生。在每一系列η = 20。与对照组相比，**Ρ〈0.01。
[0031]实验例5:雌激素对肝细胞肝癌细胞凋亡的影响:
为了了解雌激素对肝细胞肝癌细胞的作用是导致了肝细胞肝癌细胞的坏死还是凋亡。我们通过流式细胞仪检测技术、TUNEL染色技术以及透视电镜技术研究了雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721和!fepG2早期和晚期凋亡的影响。在SMMC7721和!fepG2细胞与17 β -雌二醇10 μ M作用24小时后用流式细胞仪检测细胞的早期凋亡。在SMMC7721和HepG2细胞与17 β -雌二醇10 μ M作用48小时后用TUNEL染色法和透视电镜检测细胞的晚期凋亡。结果显示17 β-雌二醇明显的诱导了 SMMC7721和!fepG2细胞的凋亡(见图5)。
[0032]图5中:A:流式细胞仪检测雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721 (Al)和H印G2(A2)早期凋亡的影响。Top panel:对照组和17 β -雌二醇(E2)组的代表性的流式细胞仪检测图。Bottom panel:对照组和17 β-雌二醇(Ε2)组结果的比较。B: TUNEL染色法检测雌激素对肝细胞肝癌细胞SMMC7721 (BI)和H印G2 (Β2)晚期凋亡的影响。Top panel:对照组和17 β -雌二醇(Ε2)组TUNEL染色的代表性的图。a是TUNEL染色法的阳性对照；b是TUNEL染色法的阴性对照；c是17 β -雌二醇(Ε2)对照组；d是17 β -雌二醇(Ε2)组。Bottom panel:对照组和17 β -雌二醇(E2)组结果的比较。C:透视电镜检测肝细胞肝癌细胞SMMC7721 (Cl)和H印G2 (C2)的晚期凋亡。结果为代表性的图。a是对照组，b是17β-雌二醇(Ε2)组。红色箭头所指为凋亡小体。透射电镜结果显示雌激素作用后，肝细胞肝癌细胞表面特殊结构微绒毛及伪足明显减少，细胞膜呈出芽状，胞浆浓缩，染色质浓密，异染色质边集，胞核和细胞外形皱着，核裂解，质膜包绕其裂解碎片，细胞膜突出形成质膜小泡，有的可见凋亡小体形成，凋亡小体内完整细胞器、致密的染色质及核碎片清晰可见。
[0033]这些结果表明雌激素能有效地抑制肝细胞肝癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞肝癌的发生，诱导肝细胞肝癌细胞的凋亡。雌激素及其受体激动剂是有希望制备出能有效治疗肝细胞肝癌的药物。
【主权项】
1.雌激素及其受体激动剂在制备抗肝细胞肝癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了雌激素及其受体激动剂在制备抗肝细胞肝癌药物中的应用，本发明发现雌激素能有效地抑制肝细胞肝癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞肝癌的发生，诱导肝细胞肝癌细胞的凋亡。雌激素及其受体激动剂是可以应用于制备能有效治疗肝细胞肝癌的药物，而雌激素及其受体激动剂在制备抗肝细胞肝癌药物中的用途属于首次公开，而且其在对于抑制人肝细胞肝癌细胞的增殖和生长方面有意想不到的作用。
【IPC分类】A61K45/00, A61P35/00, A61K31/565
【公开号】CN104906110
【申请号】CN201410388314
【发明人】庹必光
【申请人】遵义医学院附属医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年8月8日