专利名称：：硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物及其制备方法和其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型的有机硒化合物，特别涉及一种硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物及其制备方法和其应用。
背景技术：
：硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxinreductase,TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)禾口烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedi薦leotidephosphate，NADPH)。研究已表明，硫氧还蛋白(Trx)系统与癌症的关系密切l)Trx和TrxR为癌症的标志性物TrxR在肿瘤细胞中表达量是正常组织的10倍。Turunen等通过免疫组化的方法研究了Trx和TrxR在乳腺癌患者体内的表达情况，结果是Trx和TrxR在患者细胞质中的阳性率分别为67%和59%，在细胞核中的阳性率为55%和6%。并且，Trx在细胞核和细胞质中均为阳性的乳腺癌患者的癌细胞增殖很快，病程很短丄incoln等采用免疫细胞化学法测定TrxR在人原发乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌及恶性黑色素瘤中的定位与表达，结果显示，侵袭力强的肿瘤过度表达TrxR，且增殖力强、凋亡率低、转移力高。YooMH等人完成的肿瘤细胞TrxRl基因敲除实验证明，TrxRl在肿瘤细胞中是必不可少的；2)Trx系统参与肿瘤发展的不同阶段，并表现出在肿瘤细胞中过量表达、促进肿瘤增殖、表达促存活信号和启动促存活过程等特点。因此，抑制TrxR的表达对抑制肿瘤生长和转移等环节具有非常重要的作用。CN1166651C、CN1281593C、CN1242999C、CN1280279A、CN1704408A、CN1704409A、CN1704410A、CN1853627A和CN1990475A分别公开了"具有抗炎和抗肿瘤作用R-双或糖苯丙异硒唑取代化合物"、"苯并异硒唑衍生物的免疫调节和生物治疗作用"、"苯并异硒唑衍生物及其应用"、"双苯并异唑酮类化合物及其合成和应用"、"异硒唑酮类化合物和其配合物及其应用"、"具有抗纤维化及抑制明胶酶活性的化合物及其应用"、"苯并异硒唑酮衍生物及其制备方法与应用"、"双苯并异硒唑乙烷环糊精或环糊精衍生物包合物及其制备方法和其用途"、"取代苯并异硒唑酮类化合物及其用途"。这些申请或专利所公开的内容均作为本申请的参考。
发明内容本发明的目的在于提供一种硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物，所述化合物具有下述I-X结构4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明的另一目的在于提供一种具有抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性的药物组合物，由化合物i-x的任一种或其组合与药物上可接受的载体组成。本发明的另一目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的药物组合物，由化合物I-X的任一种或其组合与药物上可接受的载体组成。进一步，组合物中化合物I-X:辅料的重量比为0.001-99:1-99，优选为0.001-90:1-95，更优选为0.001-80:1-90，最优选为0.001-70:1-85。进一步，组合物中化合物I-X的重量百分含量为1-99%，优选为5-95%，还优选为10-90%，更优选为15-85%，最优选为20-80%。本发明的组合物可为本领域熟知的各种剂型。适合于本发明的剂型可以为口服制剂、外用制剂或注射剂，优选为口服制剂或注射剂。所述口服制剂选自包合制剂、分散剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、丸剂、散剂、糖浆剂、合剂、露剂、悬浮剂、泡腾剂、糊剂、混悬液、乳剂或茶剂；优选为包合制剂、或分散剂；优选所述悬浮剂选自干悬剂或悬浮液；所述外用制剂选自凝胶齐U、膏齐U、贴膏齐iJ、膏药、霜齐iJ、软膏齐iJ、搽齐iJ、洗齐iJ、栓齐iJ、涂抹剂或凝膏剂；所述注射剂选自针剂(注射液)、输液或冻干粉针等。可采用本领域熟知的制剂技术手段制备得到本发明的组合物。所述的药学上可接受的载体为本领域熟知用于制备上述制剂的常用赋形剂或辅料，口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于填充剂(又称稀释剂)、润滑剂(又称助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、矫味剂或赋香剂等。粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮，优选的纤维素衍生物为微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素；填充剂，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐、山梨醇或甘氨酸，优选无机钙盐为硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙或沉降碳酸钙；润滑剂，例如微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油或聚乙二醇；崩解剂，例如淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素，优选的淀粉衍生物为羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉或玉米淀粉；湿润剂，例如十二烷基硫酸钠、水或醇等。所述注射剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于抗氧剂，例如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠；抑菌剂，例如0.5%苯酚、0.3%甲酚、0.5%三氯叔丁醇；酸碱调节剂，例如盐酸、枸橼酸、氢氧化钾、氢氧化钠、枸橼酸钠及缓冲剂磷酸盐及其缓冲液；乳化剂，例如聚山梨酯_80、没酸山梨坦、普罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂；增溶剂，例如吐温_80、胆汁、甘油等。另外，还可将活性成分与药学上可接受的缓控释载体按其制备要求加以混合，再按照本领域熟知的缓控释制剂的制备方法，如加入阻滞剂包衣或将活性成分微囊化后再制成微丸，如缓释微丸或控释微丸；所述的缓控释载体包括但不仅限于油脂性掺入剂、亲水胶体或包衣阻滞剂等，所述的油脂性掺入剂选自单硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、矿油、聚硅氧烷或二甲基硅氧烷的任一种或其组合；所述的亲水胶体选自羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、PVP、阿拉伯胶、西黄耆胶或卡波普的任一种或其组合；所述的包衣阻滞剂选自乙基纤维素(EC)、羟丙甲基纤维素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、丙烯酸类树脂的任一种或其组合。本发明的另一目的在于提供化合物I-X或其组合物在制备具有抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性药物中的应用。本发明的另一目的在于提供化合物I-X或其组合物在制备具有抗肿瘤活性药物中的应用，所述肿瘤包括实体瘤或白血病，优选为实体瘤，所述实体瘤选自甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、颌下腺癌、鼻咽癌或乳腺癌，优选为结肠癌、胃癌、颌下腺癌。本发明的化合物I和II用于治疗肿瘤的给药剂量约为0.05-250mg/Kg体重，优选为0.5-200mg/Kg体重，更优选为2-100mg/Kg体重，最优选为5-80mg/Kg体重。化合物I和II的实际给药剂量可根据患者的病情、体质、体重、年龄、性别等因素进行适当调整。具体实施例方式以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。实施例1化合物VI的制备合成路线<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>合成步骤1)将0.lmmol的2_羟基_1，3_丙二胺溶解于20ml的二氯甲烷中，滴加0.2mmo1的三乙胺，搅拌；2)将0.lmmol的硒氯溶解于10ml的二氯甲烷中，然后在常温下将其滴加到1)步所得的反应液中，直至析出固体。MS-FAB(m/z):453。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>中间体6合成步骤2.1双硒二(5-羟基)苯甲酸(下称"中间体4")的合成2.1.l双硒化钠制备同CN1166651C中公开方法。2.1.25-羟基-2氨基苯甲酸重氮盐的制备1)在冰盐浴条件下，在烧杯中加入2.8克双硒化钠，再加入6ml盐酸和24ml水；2)取1.6克亚硝酸钠放入烧杯中，再加入6ml水和少量冰块；3)将2)步所得反应液滴加到1)步所得反应液中，充分反应，即得。2.1.3中间体4的制备1)在冰浴和ra>9条件下，将2.1.2制得重氮盐滴加到2.1.1制得的双硒化钠，室温条件下反应2h;2)将盐酸水=i:i滴加到i)步所得反应液中，滴至ra=2为止，抽滤，干燥，得固体；3)在煮沸条件下，将2)步所得固体倒入浓度为11.67%的碳酸钠水溶液中，溶解后抽滤，得滤液；4)将盐酸水=1:1滴加到3)步所得滤液中，滴至其PH=2为止，抽滤，干燥，即得。2.2中间体5的合成1)取20ml甲醇和2ml水置于烧瓶中，放入0.8g氢氧化钾，使其熔化，得熔化液；2)在油浴(80°C)条件下，在1)步所得熔化液中加入0.8g中间体4，反应0.5h，加入1.2ml.碘甲烷，反应回流16h后，加盐酸酸化和加水，加入乙酸乙酯萃取，取上层有机相；3)在2)步所得有机相中加入无水硫酸钠干燥，旋干得油状物质，经直空干燥，得固体。2.35-甲氧基-2硒氯苯甲酰氯(下称"中间体6")的合成取0.6g中间体5于烧瓶中，加入1滴DMF和5ml二氯亚砜，回流反应3h后，减压蒸馏回收二氯亚砜，加入30ml石油醚，再回流0.5h，取石油醚层，旋干石油醚层后，加入二8氯甲烷备用。2.4化合物VII的合成取适量中间体6置于圆底烧瓶中，滴入乙二胺的二氯甲烷溶液，再滴加与乙二胺等量的三乙胺，常温下搅拌2h，抽滤，得固体。MS-FAB(m/z):483。实施例3化合物VI11的制备合成路线目标产物3.12-(2-羟基)-苯并异硒唑-3-(2H)-酮(下称"中间体l")的合成取lg硒氯苯甲酰氯溶于10ml二氯甲烷中，慢慢滴加于溶有乙醇胺的二氯甲烷溶液中，滴加完全后室温反应2h，抽滤，干燥，即得。3.22-(2-氯)-苯并异硒唑-3-(2H)-酮(下称"中间体2")的合成9方法1:取lg中间体1于圆底烧瓶中，加入7ml二氯亚砜，回流8h后，减压蒸馏回收二氯亚砜，再加入乙醇旋干，尽量回收二氯亚砜。然后，注入水和乙醚萃取，取醚层；旋干醚层，干燥，即得。方法2:取0.6g二氯乙胺盐酸盐和0.6g氢氧化钠，将其溶于二氯甲烷和水的混合溶液中；将硒氯苯甲酰氯二氯甲烷溶液(lg/10ml)缓慢滴加于前述混合溶液中，室温反应3h，回流24h，即得产物。3.32-(2-氨基)-苯并异硒唑-3-(2H)-酮(下称"中间体3")的合成1)取O.21g四氮六甲圜，将其加入到10倍重量的95%的热乙醇中，再加入0.25g碘化钠，缓慢加入0.40g中间体2，反应4h，抽滤，得固体；2)用稀盐酸溶解1)步所得固体，抽滤，得水溶液；3)在2)步所得水溶液中加入氢氧化钠饱和溶液，抽滤，即得。中间体4-6的合成同实施例3。3.4化合物VIII的制备1)将0.lmmol的中间体3溶解于20ml的二氯甲烷中，滴加入0.2mmo1三乙胺，搅拌；2)将0.lmmol的中间体6溶解于10ml的二氯甲烷中，常温下将其滴加到1)步所得的反应液中，直至析出固体，即得。MS-FAB(m/z):453。实施例4化合物IX的制备合成路线<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>合成步骤1)在二氯甲烷中，加入等摩尔量的硒氯苯甲酰氯与对氨基苯甲酸，以及二倍量的三乙胺，反应3h，抽滤，干燥，得白色固体；2)在20ml乙酸酐中，加入l)步所得固体O.lmol，回流12h，减压回收乙酸酐，得到油状固体，加入异丙基醚回流萃取三次后，合并萃取液，于4t:保存，次日析出固体；3)在二氯甲烷中，加入等量的2'-脱氧_2'2'_二氟胞嘧啶盐酸盐与三乙胺，常温搅拌3h，收集析出的不溶白色固体，得2'-脱氧_2'2'-二氟胞嘧啶；4)在DMF中，加入等量的2'_脱氧_2'2'_二氟胞嘧啶盐酸盐与2)步反应所得固体，常温搅拌，24h后旋干DMF，加水，析出固体产物，即得。MS-FAB(m/z):564。实施例5化合物X的制备合成路线<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>合成步骤1)在适量二氯甲烷中，加入等量的2'-脱氧_2'2'-二氟胞嘧啶盐酸盐与三乙胺，常温搅拌3h，收集析出的固体，即得去盐酸化的2'-脱氧_2'2'-二氟胞嘧啶；2)在20ml二氯甲烷中，加入等摩尔量(0.lmmol)的2'_脱氧_2'2'_二氟胞嘧啶与硒氯苯甲酰氯，反应3h，旋干溶剂，再加入50ml水，搅拌，析出固体，即得。MS-FAB(m/z):445。实施例6化合物I-X体外对硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的抑制活性采用DTNB还原法研究化合物I-VI体外对硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的抑制活性。6.1实验材料DTNB，纯化提取的TrxR(0.34mg/mL储备液)，NADPH购自Sigma公司。6.2试验原理<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>DTNB的还原产物TNB呈黄色，在412nm有紫外吸收，可用于监测酶促反应速度，以反映TrxR的酶活力。6.3试验工作溶液配制6.3.1TrxR工作液的配制精密量取175yL浓度为0.34mg/mL的TrxR储备液，将其稀释到500iiL，将其配制成浓度为0.119mg/mLTrxR工作液；6.3.2NADPH工作液的配制精密称取5mgNADPH，将其溶于12mL磷酸钾缓冲液中，将其配制成浓度为0.5mM的工作液；6.3.3DTNB工作液的配制精密称取25mgDTNB，将其溶于63mL的DMSO中，将其配制成浓度为lmM工作液；6.3.4磷酸钾缓冲体系的配制将0.2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和lmM的EDTA加入到4的磷酸钾缓冲液中(磷酸氢二钾/磷酸二氢钾)，即得。6.4试验步骤硫氧还蛋白(Trx)系统在NADffl的参与下，催化胰岛素的二硫键还原反应，使胰岛素的二硫键被打开，胰岛素裂解为两条单链，其催化反应如下Trx-S2+NADPH+H+__Trx-(SH)2+NADP+Trx-(SH)2+胰岛素一Trx_S2+胰岛素_H2NADra在340nm下有敏感的吸光度峰，且NADffl的消耗代表了酶促反应的速度，可通过检测340nm吸光度下降的速度来反映酶活力。反应体系在O.5ml的微量比色皿中，依次加入胰岛素、NADPH、Trx和待测样品，补充反应缓冲液(0.lmol/L磷酸钾/2mmol/LEDTA)至总体积0.5ml，所得反应体系中各成份的浓度为胰岛素130iimol/L、NADPH0.4mmol/L、Trx4ymol/L和待测样品，将其置入紫外分光光度计中，连续检测反应体系在340nm处的吸光度变化。按照下述计算公式计算酶活力。活性单位定义为1U=AA340nm/mir^l000，样品中TR活性以U/L计，结果参见表1。实施例7化合物I-X的体外抗肿瘤活性研究采用MTT法研究化合物I-IX体外对乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制活性。取处于对数生长期浓度为5X104个/ml的MCF-7细胞，接种于96孔板，180y1/孔，待贴壁后每孔加入20ii1浓度分别为0iiM/ml，5iiM/ml，10iiM/ml，20iiM/ml，50iiM/ml，100iiM/ml的药物，分别于24h、48h、72h加入5mg/ml的MTT(20yl/孑L)，放入C02孵箱培养34h后，3000r/min离心，弃上清，待风干后加入酸化异丙醇，在酶标仪570nm处测OD值。细胞存活率％=(加药细胞OD-空白组OD)/(对照细胞OD-空白组OD)X100;细胞杀伤率％=1-细胞存活率％，结果参见表1。表1化合物I-X体外对硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和肿瘤细胞(MCF_7)的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>小结除X化合物外，化合物I-IX对硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的抑制活性非常明显，同时，化合物I-IX对MCF-7肿瘤也表现有效的抑制作用，由此初步推定，化合物I-IX对硫氧还蛋白还原酶的抑制作用与其抗肿瘤作用之间具有一定的相关性。权利要求一种硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物，所述化合物具有下述I-X结构2.—种具有抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性的药物组合物，由权利要求l所述的化合物i-x的任一种或其组合与药物上可接受的载体组成。3.—种具有抗肿瘤活性的药物组合物，由权利要求1所述的化合物I-X的任一种或其组合与药物上可接受的载体组成。4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，组合物中化合物I-X:辅料的重量比为0.001-99:1-99。5.根据权利要求2或3所述的药物组合物，组合物中化合物I-X的重量百分含量为1-99%。6.根据权利要求2-5任一项所述的药物组合物，所述组合物的剂型选自口服制剂、外用制剂、注射剂或其缓控释制剂。7.权利要求1所述的化合物I-X和/或权利要求2、4-6任一项所述的组合物在制备具有抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性药物中的应用。8.权利要求1所述的化合物I-X和/或权利要求3-6任一项所述的组合物在制备具有抗肿瘤活性药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，所述肿瘤包括实体瘤或白血病。10.根据权利要求9所述的应用，所述实体瘤选自甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、颌下腺癌、鼻咽癌或乳腺癌。全文摘要本发明公开了一种硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物，该类化合物还具有抗肿瘤活性，尤其表现对实体瘤的生长抑制活性，所述实体瘤选自甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、颌下腺癌、鼻咽癌或乳腺癌。文档编号C07D421/14GK101781283SQ20091007716公开日2010年7月21日申请日期2009年1月16日优先权日2009年1月16日发明者曾慧慧申请人:曾慧慧