专利名称：：镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及镰刀菌特异单链抗体，还涉及镰刀菌特异单链抗体的制备方法，还涉及镰刀菌特异单链抗体在检测镰刀菌中的应用。
背景技术：
：镰刀菌(Fusarium)是世界范围内广泛存在的赤霉病病原真菌，能够侵染小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)、燕麦(AvenasativaL.)、玉米(ZeamaysL.)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(SecalecerealeL.)等多种禾谷类作物,严重影响作物的生长发育状况及籽粒质量，或产生直接危害人畜健康的真菌毒素，引起各种急性或慢性疾病，从而造成严重的经济损失。镰刀菌侵染作物引起的各种病害是我国小麦、玉米和水稻等主要粮食作物生产上的重要病害，特别是在我国长江流域、华中、华南及东北小麦玉米种植区流行频繁，近年来已有向黄淮区扩展蔓延之势。调查也显示我国的主要粮食作物籽粒均不同程度受到镰刀菌及其产生的真菌毒素的污染。因此，监控镰刀菌的污染情况，有利于防止田间病害的大面积发生，也可控制真菌毒素进入食品或饲料中。串珠镰刀菌(F.verticillioides)是一种非常重要的镰刀菌，主要侵染玉米，引起穗腐和粒腐，产生有毒的伏马菌素(Fumonisins)、串珠镰刀菌素(Moniliformin)、镰刀菌素C(FusarinC)和镰刀菌酸(Fusarinicacid)等真菌毒素。所以本发明选用串珠镰刀菌作为原始材料制备抗原。目前用于检测镰刀菌的方法主要是生物方法和分子检测，但这些方法需要在检测前先培养真菌，样品处理过程繁琐，费时费力。此外，这些方法对技术人员和专业设备的要求也使得其难以在野外或偏远地区开展检测工作。酶联免疫吸附法(ELISA)检测除了具有很高的特异性和检测限外，还能高通量快速开展工作，不受地域和设备的限制，易于推广使用。传统的免疫学检测需要将酶或荧光染料标记到一抗或二抗上，用于ELISA检测与抗体化学交联最常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。但是，由于化学交联是一个随机的反应过程，所以有可能导致活性降低或完全失活，也可能产生抗体-抗体或酶-酶等非特异交联物。因此，需要专业的技术人员、复杂的操作和最优的反应条件来保证获得高质量的抗体-酶交联物。生物技术的发展使得这一策略发生了根本性的改变，通过基因工程技术构建表达单链抗体-碱性磷酸酶(scFv-AP)融合蛋白，被认为是快速免疫学检测的一个很好的选择。ScFv-AP融合蛋白通过原核表达系统高效表达纯化后用于抗原检测，不需要添加酶标记二抗，从而使免疫学检测的效率明显提高，而检测费用则大幅降低，应用前景十分广泛。本发明通过构建免疫抗体基因文库，利用噬菌体抗体库技术筛选获得镰刀菌特异单链抗体，再通过基因工程技术手段将单链抗体与AP在基因水平上进行融合，原核表达的scFv-AP融合蛋白可为检测和调查玉米等粮食作物、饲料以及食品或制品中镰刀菌的污染情况提供快速可靠的检测手段。
发明内容本发明目的在于提供了一种镰刀菌特异单链抗体基因，从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白(SCWPs)，免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、PhageELISA和表达ELISA鉴定，并进行序列测定，最后获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7。该基因由810个核苷酸组成，其序列为SEQIDΝΟ:1所示。重链可变区Vh由372个核苷酸组成，其序列为SEQIDNO:3所示。轻链可变区'由315个核苷酸组成，其序列为SEQIDNO5所示。本发明的另一个目的是在于提供了一种镰刀菌特异单链抗体，其序列为SEQIDNO:2所示，由269个氨基酸组成，本发明的镰刀菌特异单链抗体主要由抗体重链可变区Vh、抗体轻链可变区\和连接肽组成，抗体重链可变区Vh和抗体轻链可变区\通过连接肽(Gly4Ser)3连接共同完成镰刀菌的识别和结合。其重链可变区Vh由124个氨基酸组成，序列为SEQIDNO:4所示，轻链可变区'由105个氨基酸组成，其序列为SEQIDN0:6所示。本发明的另一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体在检测镰刀菌中的应用。本发明的另一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体的FvSG7-AP融合蛋白基因，其序列为SEQIDN0:7所示。本发明的还有一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白，其序列为SEQID勵.8所示，镰刀菌特异单链抗体基因？^^67构建到？042/5载体中获得？^^67-八卩融合蛋白表达载体，FvSG7-AP融合蛋白在大肠杆菌中进行大量表达纯化后，可直接应用于镰刀菌的检测。本发明最后一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白在检测镰刀菌中的应用。本发明克服现有检测技术存在的缺陷和不足，利用噬菌体抗体库技术筛选获得一种镰刀菌特异单链抗体，再与碱性磷酸酶构建表达融合蛋白，用于在植物或植物来源产品中镰刀菌污染情况的免疫学检测，为镰刀菌病情调查及出入境粮食和饲料中镰刀菌污染情况的检验检疫提供可靠有效的检测手段。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施本发明是这样实现的直接从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白(SCWPs)，免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、PhageELISA、表达ELISA和序列测定，最后获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7，该单链抗体与碱性磷酸酶构建融合蛋白表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达，用于检测镰刀菌的污染情况。一种镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7，其制备步骤是制备SCWPs，免疫来亨母鸡，提取其脾脏总RNA、纯化mRNA以及合成cDNA第一链，再经PCR扩增获得重链可变区(VH)、轻链可变区(')及单链抗体(scFv)基因；随后，scFv片段经酶切后连入PHENHi载体，构建单链抗体基因文库；最后，抗体基因文库经噬菌体展示淘选、PhageELISA鉴定和序列测定得到镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7，其序列为SEQIDNO1所示。一种镰刀菌特异单链抗体，其制备步骤是将含有镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7的pHENHi载体(pHENH1-FvSG7)电转化大肠杆菌XLl-BlueMRF’感受态细胞，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，然后经N1-NTA柱纯化得到FvSG7抗体，SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约35kD大小的目的蛋白，其序列为SEQIDN0:2所示。一种镰刀菌特异单链抗体在镰刀菌检测中的应用，其应用过程是表达纯化的FvSG7抗体通过酶联免疫反应(ELISA)或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于镰刀菌的检测。I)在ELISA板孔中加入100μI串珠镰刀菌SCWPs(20μg/ml)，37°C水浴包被2h。2)用200μIPBS洗涤3次。3)在抗原包被的孔及对照孔中分别加入150μI封闭液(含2%(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，于37°C水浴封闭2h。4)用200μIPBS分别洗涤3次，每次3min。5)在抗原包被孔及其对照孔中分别加入100μI封闭液稀释的含200nMFvSG7抗体，37°C反应2h。6)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。7)每孔加入100μI封闭液稀释(体积比为1:5000)的抗His单克隆抗体，37°C反应1.5h。8)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。9)每孔加入100μI封闭液稀释(体积比为1:5000)的AP标记羊抗鼠IgG抗体，37°C反应1.5h。10)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。11)每孔加入100μI显色液(O.2%(W/V)对硝基苯磷酸二钠(ρΝΡΡ)溶液)，黑暗条件下反应1530min。12)每孔加入50μINaOH溶液(3Μ)终止反应，用酶标仪测OD4tl5nm读值。表达ELISA结果显示，FvSG7抗体对串珠镰刀菌SCWPs具有很强的结合能力，OD405憧平均读值达到2.331，比阴性对照(O.055)高出42.4倍。在检测镰刀菌时，不需要提取SCWPs，将采集的样品直接研磨后即可检测。一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白，其制备步骤是镰刀菌单链抗体基因FvSG7通过酶切连入pDAP2/S载体，重组载体pDAP2/S_FvSG7电转化大肠杆菌XLl-BlueMRF’感受态细胞，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，然后经N1-NTA柱纯化得到FvSG7-AP融合蛋白。FvSG7_AP融合蛋白表达纯化后，SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约80kD大小的目的蛋白，其序列为SEQIDNO8所示。一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白在镰刀菌检测中的应用，其应用过程是表达纯化的FvSG7_AP融合蛋白通过酶联免疫反应(ELISA)或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于镰刀菌的检测。I)在ELISA板孔中加入100μI抗原SCWPs(20μg/ml)，37°C温育2h。2)用200μIPBS洗涤3次。3)加入150μI封闭液，37°C封闭2h，同时封闭空白孔作对照。4)用200μIPBS洗涤3次。5)每孔加入100μI封闭液稀释的纯化的FvSG7_AP融合蛋白(200nM)，37°C温育2h。6)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次。7)加入100μ10.2%(W/V)pNPP显色液显色1530min,读取OD405nm值。ELISA结果显示，FvSG7_AP融合蛋白对串珠镰刀菌SCWPs仍保持很强的结合能力，OD405nm平均读值达到2.304，比阴性对照(O.052)高出44.3倍。在检测镰刀菌时，不需要提取SCWPs，将采集的样品直接进行研磨处理后即可检测。本发明的有益效果1、本发明的有益效果之一是利用噬菌体抗体库技术，构建了镰刀菌特异单链抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因FvSG7。2、本发明的有益效果之二是镰刀菌特异单链抗体FvSG7可在大肠杆菌中可溶性表达，操作简单，生产成本低。3、本发明的有益效果之三是表达纯化的FvSG7抗体可用于镰刀菌的检测，包括制备检测试剂盒或蛋白芯片等用于在田间作物、饲料、粮食或食品镰刀菌污染中的检测。4、本发明的有益效果之四是FvSG7抗体与AP在大肠杆菌中融合表达，提供的FvSG7-AP融合蛋白可在重组大肠杆菌中进行大量可溶性表达，不需要贵重的仪器设备和繁锁的操作，成本低，适合大规模的生产。5、本发明的有益成果之五是表达纯化的FvSG7-AP融合蛋白可用于镰刀菌的检测，包括制备检测试剂盒或蛋白芯片等用于在田间作物、饲料、粮食或食品镰刀菌污染中的快速检测。在检测过程中不需要标签抗体和酶标记抗体，降低了检测成本，缩短了检测时间。图1:为一种技术流程2:为VH、\和scFv片段的凝胶电泳图。图中MDNA分子质量标准；泳道1:重链可变区片段(Vh);泳道2:轻链可变区片段(');泳道3:单链抗体基因片段(scFv)。图3:为一种pHENHi载体结构图。图4:为一种PhageELISA鉴定SCWPs免疫鸡源淘选抗体库示意图。图中★标记为测序的10个单克隆。图5:为一种FvSG7抗体免疫标记串珠镰刀菌孢子和菌丝的显微图像。图中a和c:显微镜明场下的串珠镰刀菌孢子；e和g:显微镜明场下的串珠镰刀菌菌丝；b和fCy3荧光检测FvSG7抗体与a和e中串珠镰刀菌孢子和菌丝的结合情况；d和hCy3荧光检测PIPP抗体(对照)与c和g中串珠镰刀菌孢子和菌丝的结合情况；标尺为10μm。图6:为一种SDS-PAGE电泳检测纯化的FvSG7抗体和FvSG7_AP融合蛋白示意图。图中M:蛋白分子量标准；泳道1:scFv_AP融合蛋白；泳道2FvSG7单链抗体。图7:为一种Westernblot分析FvSG7及其融合蛋白对串珠镰刀菌SCWPs的结合情况示意图。图中aFvSG7抗体检测；b:FvSG7_AP融合蛋白检测；M:蛋白分子质量标准。图8:为一种表面等离子共振(SPR)分析FvSG7抗体及FvSG7_AP融合蛋白的结合力示意图。图9:为一种ELISA检测FvSG7抗体及FvSG7_AP融合蛋白的最低检测限示意图。图10:为一种ELISA检测FvSG7_AP融合蛋白的最低定量限示意图。具体实施例方式实施例1:串珠镰刀菌细胞壁蛋白(SCWPs)制备I)用接种针挑取串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)whl_2(该菌株已于2010年10月28日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为=CCTCCM2010283)，接种于20mlCMC培养基(成分0.75%(W/V)羧甲基纤维素酯，O.05%(ff/V)NH4NO3,O.05%(ff/V)KH2PO4,0.025%(ff/V)MgSO4·7Η20，0·05%(W/V)酵母粉)中，28°C，200r/min振荡光照培养3天，用两层灭菌纱布过滤，收集孢子液。2)取Iml孢子液接种于160mlCzapek培养基(成分3%(W/V)蔗糖，O.3%(W/V)NaNO3,0.1%(WA)K2HPO4,0.05%(ff/V)MgSO4·7Η20,0.05%(ff/V)KCl,O.001%(ff/V)FeSO4,pH9.O)中，28°C，225r/min振荡避光培养57天。3)用2层灭菌纱布过滤培养液，并用灭菌水洗涤3次后将菌丝置于超净工作台上吹干。4)在研钵中加入液氮研磨菌丝，装入2ml离心管中，置于冰上。5)加入1.52mlCWP缓冲液(IOmMTris-HCl，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH7.8)混匀。6)4°C,50r/min旋转洗漆30min。7)4°C,4600r/min离心IOmin,弃上清。8)用预冷的CWP洗脱液(IMNaCl，ImMPMSF)洗涤35次，每次4°C，50r/min旋转洗漆30min,再4°C,4600r/min离心IOmin后弃上清。9)加入IOml含ImMPMSF的灭菌水混勻，4600r/min离心IOmin,弃上清。10)力卩入5ml处理液(50mMTris-HCl(pH8.0),0.1MEDTA,2%(W/V)SDS，IOmMDTT)悬浮沉淀，煮沸IOmin。2)室温15000r/min离心lOmin。3)吸取上清，加入4倍体积的丙酮和等体积的三氯乙酸(TCA)，充分混匀后冰上放置30min。4)4°C,15000r/min离心45min,弃上清。5)加入25ml预冷丙酮重悬沉淀，_20°C放置Ih或过夜。6)重复步骤4和5操作23次。7)弃上清，干燥5IOmin直至丙酮完全挥发。8)加入2mlPBS，超声波助溶30min。9)4°C,12000r/min离心IOmin,保留上清。10)重复步骤8和9，合并上清。ll)4°C，12000r/min离心lOmin，取上清加入超滤管，加入IOmlPBS超滤23次(4°C,4000r/min离心3060min)。12)吸取超滤液至离心管，4°C，12000r/min离心lOmin，取上清保存于_20°C备用。实施例2=SCffPs免疫来亨母鸡用制备的串珠镰刀菌SCWPs免疫来亨母鸡(购自华中农业大学养鸡场)4次，每次间隔14天。第一次取500μI免疫抗原(100μg)与500μI弗氏完全佐剂混合后免疫，后三次取500μI免疫抗原与500μI弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次免疫后第5天取血清从1:103倍比稀释至1:128Χ103，参照林巧爱、董海艳主编，《医学免疫学与微生物学实验指导》,浙江大学出版社,2006年出版介绍的间接ELISA法检测免疫鸡血清中抗体的水平。检测结果显示被免疫后的鸡血清中产生了较高的抗体滴度(稀释度>1:105)。实施例3:提取脾脏总RNA、纯化mRNA以及合成cDNA第一链I)最后一次免疫后第7天取免疫后产生较高抗血清反应的鸡的脾脏。2)利用TRNzol-A+总RNA提取试剂(购自天根生化科技(北京)有限公司产品，按照该试剂的说明书操作)提取脾脏总RNA。3)用mRNA纯化试剂盒(购自QIAGEN公司，按该试剂盒的说明书操作)对步骤2提取的总RNA进行纯化。4)用SuperScriptIII反转录酶(购自Invitrogen公司，按照该酶的说明书操作)分别以步骤3得到的mRNA为模板，用特异引物chicVHM(CGGTGGGGGACATCTGAGTGGG)反转录合成抗体重链可变区(Vh)的cDNA第一链；用特异引物chicVLM(AGGGGTGGAGGACCTGCACCTC)反转录合成轻链可变区的cDNA第一链。实施例4:PCR扩增重链可变区(VH)、轻链可变区(')及单链抗体(scFv)基因I)PCR扩增Vh和Vl基因以实施例3反转录合成的Vh的cDNA为模板，用正向引物CPDVHF(ATCTAGGCATCCCTTGGCCCAGCCGGCCATGGCTGCCGTGACGTTGGACGAGTCC)和反向引物CHICGly(GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGATGACCTCGGTCCC)进行PCR扩增获得Vh片段；以实施例3反转录合成的\的cDNA为模板，用正向引物CHICSer(GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTG)和反向引物CPDVLB(TGACCTTCGAGGATGCGCGGCCGCGTCGACGGGCTGGCCTAGGACGGTCAG)进行PCR扩增获得Vl片段。在50μIPCR反应体系中，含有4μIcDNA,5μIPCR缓冲液(含Mg2+)，8μ11.25mMdNTPs，2μI正向引物(10μΜ)，2μI反向引物(10μΜ)，2·5UTaq聚合酶。PCR反应条件为95°C5min；94°Clmin，55°Clmin，72°C80sec，30个循环；最后72°CIOmin0PCR产物通过1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，Vh和\片段大小与预期相一致。2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)分别纯化步骤I扩增得到的Vh和\片段。3)SOE-PCR扩增scFv基因加入近等摩尔的Vh和\片段作为模板，用正向引物CPDVHF和反向引物CPDVLB进行SOE-PCR扩增，获得scFv基因。SOE-PCR分两步反应完成，第一步反应在50μIPCR反应体系中，含有％和Vl片段各400ng，5yIPCR缓冲液(含Mg2+)，8μ11.25mMdNTPs,2.5UTaq聚合酶。PCR反应条件为95°C5min,55°C2min,72°C15min，7个循环；第二步反应在50μIPCR反应体系中，含有10μI第一步反应PCR产物，4μIPCR缓冲液(含Mg2+)，8μ1.25mMdNTPs，2μI正向引物(10μM)，2μI反向引物(10μM)，2.5UTaq聚合酶。PCR反应条件为95°C5min；94°Clmin,55°C80sec,72°C2min,30个循环；最后72°CIOmin0PCR产物通过1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，SCFv片段大小与预期相一致。4)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)回收纯化步骤3获得的scFv片段。实施例5=PHENHi载体及scFv片段酶切、连接I)分别用SfiI和NotI限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)双酶切载体pHENHi(PeschenD,LiHP,etal.FusionproteinscomprisingaFusarium-specificantibodylinkedtoantifungalpeptidesprotectplantsagainstafungalpathogen.Nat.Biotechnol.,2004,22:732-738,如图3所不)和实施例4得到的scFv片段。2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化步骤I酶切后的PHENHi载体和scFv片段。3)用T4DNA连接酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)连接步骤2回收的pHENHi载体和scFv片段，得到酶连接产物pHENH1-scFv。4)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法对步骤3得到的酶连接产物pHENH1-scFv进行乙醇沉淀除盐。实施例6:单链抗体基因文库构建I)大肠杆菌XLl-BlueMRF’感受态细胞制备用无菌牙签蘸取大肠杆菌菌株XLl-BlueMRF’(购自Stratagene公司),在LB固体培养基(成分1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)NaCl,l.5%(ff/V)琼脂，pH7.0)平板上划线，于37°C恒温箱培养16h后，挑取一单克隆菌落接种到5mlLB液体培养基(成分1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，1%(ff/V)NaCl,ρΗ7·0)中，37°C,200r/min振荡过夜培养16h。取1.6ml菌液加入到160mlLB液体培养基中，37°C，230r/min振荡培养至OD6tltol达到0.45左右时，取出培养菌的三角瓶置于冰上冷却30min后，将菌液分装于50ml离心管中，4°C,4000r/min离心15min,弃上清,然后用30ml预冷的10%(V/V)甘油洗涤菌体沉淀两次(4°C，4000r/min离心15min后弃上清)。最后每个离心管中加入100μI预冷的GYT培养基(成分0.25%(W/V)胰蛋白胨，0.125%(W/V)酵母提取物，10%(V/V)甘油)悬浮菌体，分装成100μI/管，立即保存于_80°C冰箱。2)电转化酶连接产物将_80°C保存的大肠杆菌XLl-BlueMRF’感受态细胞取出，置冰上溶化后，每管感受态细胞(100μI)中加入5μI酶连接产物pHENH1-scFv，小心轻微地混匀后放冰上静置3min，然后将感受态细胞转移至冰上预冷的电转化杯(0.2cm)(购自BIO-RAD公司)中，用BIO-RAD公司的MicroPulser电转化仪进行电转化(设置BacteriaEc2程序)。转化后立即加入ImlSOC培养基(成分2%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，0.05%(W/V)NaCl，20mM葡萄糖，pH7.0)到电转化杯中，并将菌液转移至离心管中，37°C，200r/min振荡培养Ih使细胞复苏。3)电转化感受态细胞涂布平板培养取出复苏后的感受态细胞，取100μI涂布于含1%(W/V)葡萄糖和100μg/ml氨节青霉素(Amp)的LB固体培养基平板用于计算单克隆菌落数。其余的菌液通过6000r/min离心Imin后吸弃部分上清，每管保留约100150μI上清重悬菌体，涂布于含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的LB固体培养基平板，置于37°C恒温箱过夜培养1216h至长出单克隆菌落。4)抗体基因文库收集保存计算电转化感受态细胞涂布平板培养后长出的单克隆菌落数量，估算抗体基因文库容量。收集LB固体培养基平板上长出的菌落，加入等体积50%(V/V)甘油保存于_80°C冰箱。通过以上步骤操作，最后构建的镰刀菌特异单链抗体基因文库容量约为4.7X107cfu。实施例7:单链抗体基因文库鉴定I)从实施例6平板上长出的转化子中随机挑取20个单克隆菌落接种到含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37°C，220r/min振荡过夜培养16h。2)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的煮沸裂解法提取质粒DNA，通过O.8%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。3)以步骤2得到的质粒DNA为模板，用正向引物pHENpel(GCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGC)和反向引物pHENmyc(ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG)进行PCR扩增。在25μIPCR反应体系中，含有50ng质粒DNA，2.5μIPCR缓冲液(含Mg2+)，2μ11.25mMdNTPs,IμI正向引物pHENpel(10μΜ)，IμI反向引物pHENmyc(10μΜ)，1.25UTaq聚合酶。PCR反应条件为94°C5min；94°C50sec,48°C90sec,72°C90sec，30个循环；最后72°CIOmin0PCR产物通过1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。4)用BstNI限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)酶切步骤3扩增的PCR产物，酶切产物通过1.5%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的多样性。鉴定结果显示，构建的抗体基因文库阳性率达到100%，多样性高于70%，说明构建的文库质量较高，可用于特异单链抗体的筛选。实施例8:噬菌体展示筛选单链抗体基因文库I)取实施例6收集保存的菌液(抗体基因文库)500μI加入到50ml含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的2XTY培养基(成分1.6%(W/V)胰蛋白胨，1%(W/V)酵母提取物，O.5%(ff/V)NaCl,ρΗ7·O)中，37°C，200r/min振荡培养至OD600nm达到O.5。2)取5ml菌液于50ml离心管中，加入O.5μIMl3Κ07辅助卩遼菌体(购自AmershamBiosciences公司，参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备保存，其中噬菌体的量为大肠杆菌的20倍)，混匀后于37°C水浴静置30min。3)4000r/min离心lOmin，弃上清，然后重悬于140ml含100μg/mlAmp和25μg/ml卡那霉素(Kan)的2XTY培养基中，30°C，200r/min振荡过夜培养至少15h。4)将过夜培养的菌液分装于50ml离心管中，4°C,4000r/min离心30min。5)取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液(20%(W/V)聚乙二醇(PEG)6000，2·5MNaCl),充分混匀后置冰上沉淀lh。6)4°C,8000r/min离心30min,弃上清,将沉淀重悬于40ml灭菌水中，并立即加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，充分混匀后4°C放置20min。7)4°C,4000r/min离心30min,弃上清。8)轻微离心，去除残留的PEG/NaCl溶液。9)加入1.6ml灭菌水重悬沉淀，4°C,12000r/min离心lOmin,取上清于4°C保存。10)用串珠镰刀菌SCffPs包被ELISA板(共20孔，每孔100μI)，37°C水浴2h。11)用磷酸盐缓冲液(PBS)(成分137mMNaCl,2.7mMKCl,IOmMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,ρΗ7·27·4)洗涤3次。12)每孔加入150μI封闭液(含2%(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，37°C水浴封闭2h(用封闭液封闭一空白孔作为阴性对照)。10)用200μIPBS分别洗涤3次，每次3min。11)每孔中加入100μI步骤9保存的上清(噬菌体)，37°C水浴2h。12)用200μIPBST(含O.1%(V/V)Tween20的PBS)和PBS分别洗涤5次，每次3min(第二轮和第三轮淘选时增加洗涤次数至10次和15次)。13)每孔加入ΙΟΟμI三乙胺溶液(IOOmM),室温放置lOmin。14)立即加入50μITris-HCl溶液(1Μ，ρΗ7·4)中和，并转移至50ml离心管中。15)取6ml在37°C，230r/min振荡培养条件下生长至OD6tltlnm为0.50.9的大肠杆菌XLl-BlueMRF’加入到50ml离心管中，37°C水浴侵染30min。16)4000r/min离心lOmin,弃上清。17)加入800μILB培养基重悬菌体后涂布于TYE固体培养基(成分1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，0.8%(W/V)NaCl,l.5%(W/V)琼脂，ρΗ7·0)平板上，37°C恒温箱过夜培养1216h至长出菌落。18)收集TYE固体培养基平板上长出的菌落，进行下一轮淘选或加入等体积50%(V/V)甘油保存于-80°c冰箱。实施例9=PhageELISA鉴定淘选抗体库I)在96孔细胞培养板孔中加入180μI含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的2XTY培养基，用灭菌牙签从第三轮淘选抗体库的菌落中随机挑取48个单克隆接种，30°C，150r/min振荡过夜培养16h。2)在另一96孔培养板孔中加入180μ12XTY培养基(含1%(W/V)葡萄糖，100μg/mlAmp以及约IO8辅助噬菌体M13K07)，再加入20μI过夜培养菌液，37°C，150r/min振荡培养2h。3)室温1800r/min离心IOmin,弃上清。4)加入180μI含100μg/mlAmp和50μg/mlKan的2XTY培养基至培养板孔中，37°C,150r/min振荡过夜培养16h。5)1800r/min离心lOmin,培养基上清用于phageELISA检测。6)在ELISA板孔中加入100μISCWPs(50μg/ml)或PBS(对照)，37°C水浴包被2h。7)用200μIPBS洗涤3次。8)加入150μI封闭液(含2%(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，37°C水浴封闭2h。9)用200μIPBS洗涤3次。10)加入50μI步骤5收集的培养基上清，并加入50μI封闭液，37°C反应2h。11)用PBST和PBS分别洗涤3次。12)加入ΙΟΟμ11:5000(V/V)稀释的HRP标记鼠抗M13抗体，37°C反应2h。13)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次。14)加入100μI可溶性单组份TMB底物(购自天根生化科技(北京)有限公司)，黑暗条件下反应1530min。15)加入50μIH2SO4溶液(2Μ)终止反应，用酶标仪测OD45tlnm读值。PhageELISA鉴定结果显示，48个单克隆样品中有33个显色(如图4所示)，从其中挑取显色较高的10个单克隆样品(图4中★标注)的培养菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，分析结果显示它们具有一致的核苷酸序列(命名为FvSG7)，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如序列表SEQIDΝ0:2所示。含有该基因的大肠杆菌命名为重组大肠杆菌XLl-BlueMRF’/pHENHi_FvSG7，单克隆培养菌液加等体积50%(V/V)甘油保存于_80°C冰箱。实施例10:重组大肠杆菌超量表达、纯化FvSG7抗体I)取5μI甘油保存的重组大肠杆菌XLl-BlueMRF’/pHENH1-FvSG7接种于20ml含1%(W/V)葡萄糖和ΙΟΟμg/mlAmp的2XTY培养基中，37°C，200r/min振荡过夜培养12h。2)取8ml过夜培养菌液加入160ml含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的2XTY培养基中，37°C，200r/min振荡培养至OD6tltlnm达到O.5左右。3)加入终浓度为O.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，置于30°C，200r/min诱导表达8h。4)取培养菌液分装到50ml离心管中，4°C,5000r/min离心lOmin,弃上清。5)每管中加入500μIPPP溶液(30mMTris-HCl,20%(W/V)蔗糖，ρΗ8·0)重悬菌体，再加入IμI乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(终浓度ImM)，冰上放置15min。6)4°C,5000r/min离心15min,上清装入另一离心管中。7)每管中加入ImlMgCl2溶液(终浓度5mM)重悬菌体，再加入2μIEDTA溶液(终浓度ImM)，冰上放置15min。8)4°C,5000r/min离心15min,上清与步骤6上清合并。9)取收集步骤6和8上清的离心管于4°C,12000r/min离心15min。10)取上清用PBS透析72h。11)安装纯化柱(购自BIO-RAD公司)，加入400μI充分混匀的基质(购自QIAGEN公司)，使其固定2h以上。12)剪去下端封口，使液体流下，用5mlPBS进行平衡。13)加入步骤10透析后的单链抗体样品过柱，收集保存过柱后的样品流出液。14)加入Iml缓冲液B(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，20mM咪唑，ρΗ8·0)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为Β1、Β2、Β3(杂蛋白)。15)加入400μI缓冲液C(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，250mM咪唑，ρΗ8·0)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为Cl、C2、C3(目的蛋白)。16)加5mlPBS平衡纯化柱后，加入Iml30%(V/V)酒精4°C保存纯化柱。17)重组抗体通过SDS-PAGE电泳检测(实施例11)后用PBS.透析。实施例11:SDS-PAGE电泳检测纯化的FvSG7抗体I)取10μI实施例10纯化的FvSG7抗体，加入2.5μ15X十二烷基硫酸钠(SDS)加样缓冲液(250mMTris-HCl(pH6.8),10%(ff/V)SDS(电泳级)，0.5%(W/V)溴酚蓝，50%(V/V)甘油，5%(ff/V)β-巯基乙醇)，充分混匀，水浴煮沸5min，然后置于冰上备用。2)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备分离胶和浓缩胶。3)安装蛋白垂直电泳系统(购自BIO-RAD公司)，加入IXTriS-甘氨酸电泳缓冲液(25mMTris，250mM甘氨酸，O.1%(W/V)SDS)，取放置在冰上的样品上样。4)先设置电压80伏电泳20min，再用120伏电压电泳80120min至溴酚蓝跑至分离胶外。5)取下凝胶，去掉浓缩胶后用染色液(O.1%(W/V)考马斯亮蓝R-250，25%(V/V)异丙醇，10%(V/V)冰醋酸)染色30min。6)用脱色液(5%(V/V)甲醇，7.5%(V/V)冰醋酸)脱色35次，观察照相。SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约35kD大小的目的蛋白。实施例12:表达ELISA检测FvSG7抗体I)在ELISA板孔中加入100μI串珠镰刀菌SCWPs(20μg/ml)，37°C水浴包被2h。2)用200μIPBS洗涤3次。3)在抗原包被的孔及对照孔中分别加入150μI封闭液(含2%(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，37°C水浴封闭2h。4)用200μIPBS分别洗涤3次，每次3min。5)在抗原包被孔及其对照孔中分别加入100μI封闭液稀释的含200ηΜ实施例10纯化的FvSG7抗体，37°C反应2h。6)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。7)每孔加入ΙΟΟμI封闭液稀释(体积比为1:5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37°C反应1.5h。8)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。9)每孔加入ΙΟΟμI封闭液稀释(体积比为1:5000)的AP标记羊抗鼠IgG抗体(购自Sigma公司)，37°C反应1.5h。10)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。11)每孔加入ΙΟΟμI显色液(0.2%(W/V)对硝基苯磷酸二钠(ρΝΡΡ)溶液)，黑暗条件下反应1530min。12)每孔加入50μINaOH溶液(3Μ)终止反应，用酶标仪测OD4tl5nm读值。表达ELISA结果显示，FvSG7抗体对串珠镰刀菌SCWPs具有很强的结合能力，OD405憧平均读值达到2.331，比阴性对照(0.055)高出42.4倍。实施例13:免疫荧光检测FvSG7抗体的结合特性I)按实施例1的步骤I培养串珠镰刀菌孢子。2)取IO5孢子液接种于20mlYPG培养基(成分0.3%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)蛋白胨，2%(W/V)葡萄糖)中，28°C，200r/min振荡避光培养1216h至大部分孢子萌发。3)用2MNa0H浸泡盖玻片2h，再用蒸馏水清洗。4)多聚赖氨酸浸泡盖玻片5min，用蒸馏水清洗。5)向12孔细胞培养板孔中加入2ml2%(W/V)小牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)溶液，37°C保湿封闭2h。6)用2mlPBS洗涤3次。7)在细胞培养板孔中放入盖玻片，加入Iml萌发孢子液。8)细胞培养板在室温条件下,2800r/min离心15min。9)用2mlPBS洗涤3次。10)加入500μI实施例10纯化的FvSG7抗体(Iμg/ml)，37°C保湿反应2h。11)用2mlPBST和PBS分别洗涤3次。12)加入500μ11:3000(V/V)稀释的抗His单克隆抗体，37°C保湿反应2h。13)用2mlPBST和PBS分别洗涤3次。14)加入500μ11:100(V/V)稀释的Cy3标记羊抗鼠IgG(H+L)抗体(购自美国ProteinTechGroup公司)，37°C反应lh。15)用2mlPBST和PBS分别洗涤3次。16)在载玻片上滴加封片剂,盖上盖玻片，置于突光显微镜下观察。免疫荧光实验结果如图5所示，加入FvSG7抗体反应后，在串珠镰刀菌孢子和菌丝的表面都有很强的荧光亮度(图5b和5f)，而对照加入人类绒毛促性腺素特异单链抗体PIPP(KathuriaS，SriramanR,etal.Efficacyofplant-producedrecombinantantibodiesagainstHCG.Hum.Reprod.,2002,17:2054-2061.)与菌丝或抱子反应后，未见任何荧光反应(图5d和5h)，说明FvSG7抗体能与串珠镰刀菌孢子和菌丝细胞壁表面的靶抗原特异结合。实施例14FvSG7-AP融合蛋白表达载体构建、原核表达和纯化I)FvSG7抗体基因通过SOE-PCR扩增在3’端加上218连接肽(WhitlowM,BellBA,etal.Animprovedlinkerforsingle-chainFvwithreducedaggregationandenhancedproteolyticstability.Protein.Eng.,1993,6:989-995.),然后利用SfiI和NotI内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)酶切后直接连接到PDAP2/S载体(KerschbaumerRJ,HirschlS，etal.Single-chainFvfusionproteinssuitableascoatinganddetectingreagentsinadoubleantibodysandwichEnzyme-linkedimmunosorbentassay.Anal.Biochem.,1997,249:219-227.)中，得到含有FvSG7_AP融合蛋白基因的重组质粒，电转化到E.coliXLl-BlueMRF’感受态细胞(方法见实施例6步骤2)中，挑取单克隆培养后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，得到含有重组质粒DNA的重组大肠杆菌。2)FvSG7-AP融合蛋白的表达和纯化按实施例10的方法操作，但步骤3诱导表达为16°C诱导表达20h。FvSG7-AP融合蛋白表达纯化后，SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约80kD大小的目的蛋白。实施例15FvSG7-AP融合蛋白活性检测I)在ELISA板孔中加入100μI抗原SCWPs(20μg/ml)，37°C温育2h。2)用200μIPBS洗涤3次。3)加入150μI封闭液，37°C封闭2h，同时封闭空白孔作对照。4)用200μIPBS洗涤3次。5)每孔加入100μI封闭液稀释的实施例14纯化的FvSG7_AP融合蛋白(200nM)，37°C温育2h。6)用200μIPBST和PBS分别洗涤3次。7)加入100μ10.2%(ff/V)ρΝΡΡ显色液显色1530min,读取OD405nm值。ELISA结果显示，FvSG7_AP融合蛋白对串珠镰刀菌SCWPs仍保持很强的结合能力，OD405nm平均读值达到2.304，比阴性对照(O.052)高出44.3倍。实施例16=ELISA分析FvSG7抗体和FvSG7_AP融合蛋白的结合特性I)选取23个镰刀菌和其它真菌菌株(见表I)，按实施例1的步骤I培养真菌孢子。2)取IOVml孢子液接种于2mlYPG培养基中，28°C，200r/min振荡避光培养1216h至大部分孢子萌发。3)在ELISA板孔中加入100μI真菌萌发孢子液，37°C水浴包被2h。4)分别用FvSG7抗体和FvSG7_AP融合蛋白检测。①FvSG7抗体检测按实施例12步骤212操作。②FvSG7_AP融合蛋白检测按实施例15步骤27操作。ELISA结果见表1，结果表明FvSG7抗体和FvSG7_AP融合蛋白对镰刀菌都具有很高的亲和力，而与其它真菌无交叉反应，说明FvSG7-AP融合蛋白保留了FvSG7抗体的亲和力和特异性。表IELISA检测分析FvSG7抗体和FvSG7_AP融合蛋白的亲和力和特异性权利要求1.一种镰刀菌特异单链抗体基因，其特征在于基因FVSG7，其序列为SEQIDNO:1所/Jnο2.权利要求1所述的一种镰刀菌特异单链抗体基因，其特征在于该基因的重链可变区Vh由372个核苷酸组成，其核苷酸序列为SEQIDNO:3所示；轻链可变区'由315个核苷酸组成，其核苷酸序列为SEQIDNO:5所示。3.一种镰刀菌特异单链抗体，其特征在于FvSG7抗体，其序列为SEQIDNO2所示。4.权利要求3所述的一种镰刀菌特异单链抗体，其特征在于其重链可变区Vh由124个氨基酸组成，序列为SEQIDNO4所示；轻链可变区\由105个氨基酸组成，其序列为SEQIDNO6所示。5.一种镰刀菌特异单链抗体重组基因，其特征在于基因FvSG7-AP，其序列为SEQIDNO7所示。6.一种镰刀菌特异单链抗体融合蛋白，其特征在于FvSG7-AP融合蛋白，其序列为SEQIDNO8所示。7.权利要求3所述的一种镰刀菌特异单链抗体在镰刀菌检测中的应用。8.权利要求6所述的一种镰刀菌特异单链抗体融合蛋白在镰刀菌检测中的应用。全文摘要本发明公开了镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用，从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白，免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选、PhageELISA、表达ELISA和序列测定，获得了一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7，并与碱性磷酸酶基因构建融合蛋白表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达，得到镰刀菌特异单链抗体FvSG7和FvSG7-AP融合蛋白，该抗体和融合蛋白可用于在植物或植物来源产品中镰刀菌污染情况的免疫学检测，为镰刀菌病情调查及出入境粮食和饲料中镰刀菌污染情况的检验检疫提供可靠有效的检测手段。文档编号C07K19/00GK103014012SQ201210574749公开日2013年4月3日申请日期2012年12月26日优先权日2012年12月26日发明者廖玉才,胡祖权,李和平,张静柏申请人:华中农业大学