用于抑制蛋白酶体酶的化合物的制作方法

用于抑制蛋白酶体酶的化合物的制作方法
【专利摘要】基于肽的化合物，包括含杂原子的三元环，有效而选择性地抑制N端亲核（Ntn）水解酶的特定活性。所述化合物对那些具有多活性的Ntn的各个活性进行不同的抑制。例如，本发明化合物可选择性抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。基于肽的化合物包括至少三个肽单位、一个环氧化物或氮杂环丙烷，以及在N端具有官能作用。基于肽的化合物混入其它治疗用剂，预期具有抗炎特性和抑制细胞增殖作用。
【专利说明】用于抑制蛋白酶体酶的化合物
[0001]本申请是2005年4月14日提交的题为“用于抑制蛋白酶体酶的化合物”的国家申请号为200580019845.4(PCT / US2005 / 012740)的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于抑制酶的化合物和方法。具体地，本发明涉及基于酶抑制的治疗方法。
[0003]发明背景
[0004]在真核生物中，主要通过泛素(ubiquitin)途径介导蛋白质降解，其中降解的目标蛋白质与76氨基酸的多肽泛素连接。一旦成为目标，泛素化蛋白就成为26S蛋白酶体的底物,26S蛋白酶体是多催化功能蛋白酶(Multicatalytic protease),通过其三种主要的蛋白酶解活性将蛋白质切割成短肽。蛋白酶体介导的降解虽然在胞内蛋白质转换中具有一般性功能，但在诸如I类主要组织相容性复合体(MHC)的呈递、凋亡、细胞分化以及NF-K B活化等多个过程中也发挥重要作用。
[0005]20S蛋白酶体是700kDa的圆筒状多催化功能蛋白酶复合体，含有构成4个环的28个亚基，在细胞生长调节、I类主要组织相容性复合体的呈递、调亡、抗原加工、NF-K B活化和促炎信号的转导中起重要作用。在酵母和其它真核细胞中，7个不同的α亚基构成外环，7个不同的β亚基构成内环。α亚基用作19S(PA700)和11S(28PA)调节复合体的结合位点，以及两个β亚基环构成的内蛋白酶解腔的物理屏障。因此认为，该蛋白酶体在体内以26S颗粒(“26S蛋白酶体”)形式存在。体内试验表明，对20S形式的蛋白酶体的抑制容易与对26S蛋白酶体的抑制相关。颗粒形成期间对氨基端β亚基原序列(prosequence)的切割，使得用作催化亲核体的氨基端苏氨酸残基暴露出来。于是，蛋白酶体中负责催化活性的亚基对氨基端亲核残基进行加工，这些亚基属于N端亲核(Ntn)水解酶家族(其中亲核的N端残基是诸如半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸等亲核成分)。该族包括，例如，青霉素G酰基转移酶(PGA)、青霉素V酰基转移酶`(PVA)、谷氨酰胺PRPP酰氨基转化酶和细菌糖基天冬酰胺酶。除了遍在表达的β亚基，更高等的脊椎动物还拥有3个Y-干扰素诱导型β亚基(LMP7、LMP2和MECL1)，分别替代其正常的对应亚基X、Y和Ζ，这样改变了蛋白酶体的催化活性。通过使用不同的肽底物，将真核生物20S蛋白酶体的三种主要的蛋白酶解活性定义为:胰凝乳蛋白酶样活性(CT-L)，在大的疏水残基之后进行切割；胰蛋白酶样活性(T-L)，在碱性残基之后进行切割；以及肽基谷氨酰基肽水解活性(PGPH)，在酸性残基之后进行切害I]。蛋白酶体还有另外两个较次要的特征活性=BrAAP活性，在支链氨基酸之后进行切割；SNAAP活性，在小的中性氨基酸之后进行切割。蛋白酶体的主要蛋白酶解活性似乎由不同的催化位点引起，因为抑制剂、β亚基中的点突变以及Y-干扰素诱导型β亚基的交换使得这些活性发生各种程度的变化。
[0006]已有一些实例小分子用于抑制蛋白酶体的活性；但是，这些化合物一般缺乏在细胞和分子水平上探究和开发蛋白酶体功用所必需的专一性、稳定性或潜力。因此，需要合成位点专一性得到提高、稳定性和溶解性得到改善，潜力得到增强的小分子抑制剂，从而能够在细胞和分子水平上对蛋白酶体的功用进行探究。
[0007]发明概沭
[0008]本发明涉及被称为肽α ’，β ’ -环氧化物和肽α ’，β ’ -氮杂环丙烷的分子种类的类似物和前药。母体分子被确信为有效地、不可逆地且选择性地与N端亲核(Ntn)水解酶结合，能专一性抑制具有多催化活性的酶的特定活性。
[0009]曾经认为蛋白酶体仅仅处理变性的及错折叠的蛋白质，现在认识到它构成了通过依赖信号的降解方式，调节多种胞内蛋白质的水平的蛋白酶解机制。因此，人们对于鉴别能专一性干扰蛋白酶体和其它Ntn水解酶活性的试剂，从而将其用作研究这些酶在生物加工中的作用的探针怀有极大的兴趣。这里对用于靶向Ntn水解酶的化合物的类似物和前药进行了描述、合成和研究。公开了能有效地、选择性地和不可逆地抑制特定的蛋白酶体活性的肽环氧化物和肽氮杂环丙烷，并对其要求保护。
[0010]不同于一些其它的基于肽的抑制剂，不能预期这所述的肽环氧化物和肽氮杂环丙烷在浓度高达50 μ M时充分抑制非蛋白酶体的蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶、需钙蛋白酶。在较高的浓度下，可以观察到抑制作用，但如果抑制剂仅仅与底物竞争，预期该抑制作用是竞争性的和可逆的。还预期该新颖的肽环氧化物和肽氮杂环丙烷能抑制NF- K B的活化，稳定细胞培养物中的ρ53水平。另外，预期这些化合物具有抗炎活性。因此，这些化合物可作为独特的多功能性分子探针，以探究Ntn酶在正常生物学过程和病理学过程中的功能。
[0011]一方面，本发明提供包括含杂原子的三元环的抑制剂类似物和前药。当所述抑制剂的存在浓度低于约50 μ M时，这些抑制剂可抑制N端亲核水解酶(例如20S蛋白酶体或26S蛋白酶体)的催化活性。对于20S蛋白酶体，特定的水解酶抑制剂在其存在浓度为低于约5μΜ时，抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，而当其存在浓度为低于约5μ M时，不抑制20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性或PGPH活性。水解酶抑制剂可以为，例如，肽α ’，β ’ -环氧酮或α ’，β 氮杂环丙烷酮，该肽可以是四肽。该四肽可包括分支或不分支的侧链，如氢、C1^6烷基、CV6羟烷基、C1^6烷氧基烷基、芳基、CV6芳烷基、C1^6烷基酰胺、C1^6烷基胺、Ck竣酸、CV6竣酸酷、C^6烷基硫醇或Cu烷基硫酿，例如异丁基、1-蔡基、苯甲基和2-苯乙基。这里定义的α’，环氧酮或α’，氮杂环丙烷酮中的α’-碳可以是手性碳原子，例如(R)或β构型的碳。
[0012]另一方面，本发明提供药物组合物，包括一种药学上可接受的载体和一种改善神经变性疾病(如阿尔茨海默尔氏病)、肌肉萎缩病(muscle-wasting diseases)、癌症、慢性传染病、发热、肌肉废用(muscle disuse)、去神经、神经损伤、禁食和免疫相关的病症的药学有效量的水解酶抑制剂类似物或前药以及其它物质。
[0013]另一方面，本发明提供抗炎组合物。
[0014]另一方面，本发明提供用于以下方面的方法:抑制或减轻个体的HIV感染；影响个体中的病毒基因表达水平；改变生物体中蛋白酶体所产生的抗原肽的品种；确定生物体中的细胞的、发育的或生理的过程或产量是否受特定Ntn水解酶的蛋白酶解活性的调节；对个体的阿尔茨海默尔氏病进行治疗；降低细胞中肌肉蛋白的降解速度；降低细胞内胞内蛋白的降解速度；降低细胞内P53蛋白的降解速度；抑制个体中p53相关癌的生长；抑制细胞内的抗原呈递；对个体的免疫系统进行阻抑；抑制生物体中的I K Β-α降解；减少细胞、肌肉、器官或个体体内的NF-K B含量；影响依赖于细胞周期蛋白的真核细胞周期；对个体的增生性疾病进行治疗；影响细胞内蛋白酶体依赖性的肿瘤蛋白调节；治疗个体的癌症生长；治疗个体中的P53相关性调亡；筛选细胞内N端亲核水解酶加工的蛋白质。这些方法中的每一种包括对个体、细胞、组织、器官或生物体施用有效量的包含这里所揭示的水解酶抑制剂的组合物，或使个体、细胞、组织、器官或生物体与有效量的组合物接触。
[0015]本发明的其它特征和优点将在以下的详细描述和权利要求中得到体现。
[0016]发明详沭 [0017]本发明涉及用作酶抑制剂的化合物。这些化合物通用于对N端具有亲核基团的酶进行抑制。例如，这里所述的酶抑制剂可成功抑制含有侧链带亲核体的N端氨基酸(如苏氨酸、丝氨酸或半胱氨酸等)的酶或酶亚基的活性。这里所述的酶抑制剂也能成功抑制在其N端具有非氨基酸亲核基团(例如保护基或碳水化合物)的酶或酶亚基的活性。
[0018]虽然没有任何具体的作用原理加以限定，人们认为这种Ntm的N端亲核体与这里所述的酶抑制剂的环氧化物官能团形成共价加合物。例如认为在20S蛋白酶体的β 5/Pre2亚基中，N端苏氨酸与肽环氧化物或肽氮杂环丙烷(例如下文所描述的化合物)反应，不可逆地形成吗啉代加合物或哌嗪子基加合物。这种加含物的形成涉及环氧化物或氮杂环丙烷的开环裂解。
[0019]包括与α ’碳结合的此种基团的实施方式中，α ’ -碳(形成环氧化物或氮杂环丙烷环的一部分的碳)的立体化学可以是(R)或(S)。本发明部分基于这里所揭示的结构-功能信息，该信息提示了下列优选的立体化学关系。注意，优选的化合物可含有若干立构中心，立构中心具有上-下(或β-α，其中这里绘制的β在页面的上方)或(R)-(S)的显示关系(不需要化合物中的每一个立构中心都符合所述的优选方式)。在一些优选的实施方式中，α ’碳的立体化学为(R)，即，X原子为β，或位于分子平面的上方。
[0020]对于立体化学，遵循用于确定绝对立体化学的Cahn-1ngold-Prelog规则。诸如有机化学(Fox和Whitesell ;琼斯和巴特利特出版社，波士顿，ΜΑ(1994) ;5_6节，177-178页，这里整体参考该节内容)等对这些规则进行了描述。肽可具有重复主链结构，从主链单位中伸展出侧链。一般地，每个主链单位具有一条与之缔合的侧链，尽管有时候，该侧链是一个氢原子。其它实施方式中，并非每个主链单位均具有一条缔合的侧链。用于肽环氧化物或肽氮杂环丙烷的肽具有两个或更多个主链单位。一些用于抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样(CT-L)活性的实施方式中，存在4-8个主链单位，一些用于抑制CT-L的优选实施方式中，存在4-6个主链单位。
[0021]从主链单位伸展出来的侧链可包括天然的脂族或芳族氨基酸侧链，如氢(甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、仲丁基(异亮氨酸)、异丁基(亮氨酸)、苯甲基(苯丙氨酸)以及构成脯氨酸的侧链。侧链也可以是其它分支或不分支的脂族基或芳香基，例如乙基、正丙基、正丁基、叔丁基和芳基取代的衍生物，如1-苯乙基、2-苯乙基、(1-萘基)甲基、(2-萘基)甲基、(1-萘基)乙基、1_(2_萘基)乙基、2_(1_萘基)乙基、2_(2_萘基)乙基及类似的化合物。芳基可进一步被分支或不分支的(V6烷基或取代烷基、乙酰基等取代，或被其它的芳基或诸如苯甲酰基等取代芳基等取代。杂芳基也可用作侧链取代基。杂芳基包括含氮、氧和硫的芳基，如噻吩基、苯并噻吩基、萘并噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、喷哚基、嘌呤基、喹啉基等。
[0022]一些实施方式中，可在肽环氧化物或肽氮杂环丙烷中弓丨入极性残基或带电残基。例如可以引入天然存在的氨基酸(如含羟基(Thr、Tyr、Ser)或含硫(Met、Cys)氨基酸)以及诸如牛磺酸、肉碱、瓜氨酸、胱氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸及其它氨基酸等非必需氨基酸。还可以包括含有带电部分或极性部分的非天然存在的侧链取代基，例如，含有一个或更多个羟基、短链烷氧基、硫醚(sulfide)、硫代、羧基、酯、二氧磷基、酰氨基或氨基或被一个或更多个卤原子取代的这类取代基的CV6烷基链或C6_12芳基。一些优选的实施方式中，肽部分的一条侧链中具有至少一个芳基。
[0023]一些实施方式中，主链单位为酰胺单位[-NH-CHR-C ( = O)-]，其中R为侧链。这种指定不排除天然存在的脯氨酸或本领域熟练人员认可的其它非天然存在的环状二级氨基酸。
[0024]另外的实施方式中，主链单位是N烷基化的酰胺单位(例如，N-甲基等)、烯烃类似物(其中一个或更多个酰胺键被烯键取代)、四唑类似物(其中四唑环在主链上呈顺式构型)或这些主链键的组合。在其它实施方式中，氨基酸α-碳经α-烷基取代修饰，例如，氨基异丁酸。又一些实施方式中，对侧链进行局部修饰，例如进行八￡或八^兑氢修饰，其中在侧链的α原子与β原子之间存在双键，或例如进行Ae或Az环丙基修饰，其中在侧链的α原子与β原子之间存在环丙基。另外的采用氨基酸基团的实施方式中，可使用D-氨基酸。进一步的实施方式可包括侧链向主链环化、二硫键形成、内酰胺形成、偶氮键以及在“肽以及构象限制模拟、设计”(Hruby和Boteju)、“分子生物学和生物技术:综合性的案头参考书” (Robert A.Meyers编，VCH出版社(1995)，658-664页，在这里综合参考)中讨论的其它修饰。
[0025]某些实施方式中，主题化合物是序列号为09/569748的美国申请所公开的化合物的类似物或前药，这里对该申请的整体内容进行综合参考。合适的酶抑制剂类似物或前药可具有式(I)的结构或其药学上可接受的盐，
`[0026]

O R2 R13 O R4

R1 R12 O R3 R14 O
O)
[0027]其中每个A独立选自C=O、C=S和SO2,优选C=O ;或
[0028]当与存在的Z相邻时，A任选为共价键；
[0029]L不存在或选自C=0、C=S和SO2，优选L不存在或为C=O ；
[0030]M不存在或为CV12烷基，优选为Ci_8烷基；
[0031]Q不存在或选自O、NH和N-Ch烷基，优选Q不存在或为O或NH，最优选Q不存在或为O ;
[0032]X选自O、NH和N-Cp6烷基，优选为O ;
[0033]Y 不存在或选自 O、NH 和 N-C1-J5 烷基、S、SO、SO2, CHOR10 和 CHCO2Rici ；
[0034]每个Z独立选自O、S、NH和N-Cp6烷基，优选为O ;或[0035]当与存在的A相邻时，Z任选为共价键；
[0036]R1、R2、R3和R4各自独立选自(^_6烷基、C^6羟烷基、(^_6烷氧基烷基、芳基和C^6芳烷基，其中的任何基团任选地被一个或更多个酰胺、胺、
[0037]羧酸(或其盐)、酯(包括Cp5烷基酯和芳基酯)、硫醇或硫醚取代基取代；
[0038]R5SN(R6)LQR7;
[0039]R6、R12、R13和R14独立选自氢、OH、C^6烷基和式IV的基团；优选地，R6选自氢、OH和
CV6烷基，且R12、R13和R14独立选自氢和Cp6烷基(优选氢);
[0040]
【权利要求】
1.一种具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐，
2.权利要求1所述的化合物，其中R1、R2、R3和R4独立选自C^6烷基和Cu芳烷基。
3.权利要求2所述的化合物，其中R1和R3均为CV6芳烷基，且R2和R4均为CV6烷基。
4.权利要求3所述的化合物，其中X为O，R1为2-苯乙基，R2为异丁基，R3为苯甲基，R4为异丁基。
5.权利要求4所述的化合物，其中L和Q不存在，且R6为Cu烷基。
6.权利要求5所述的化合物，其中R7选自C^6烷基、CV6烯基、Cu炔基、Cu芳烷基和C1^6杂芳烷基。
7.权利要求6所述的化合物，其中R7是C^6烷基。
8.权利要求7所述的 化合物，其中R7是丁基。
9.权利要求6所述的化合物，其中R7是C^6烯基。
10.权利要求9所述的化合物，其中R7是烯丙基。
11.权利要求6所述的化合物，其中R7是C^6炔基。
12.权利要求11所述的化合物，其中R7是炔丙基。
13.权利要求6所述的化合物，其中R7是Cu芳烷基。
14.权利要求13所述的化合物，其中R7是苯甲基。
15.权利要求6所述的化合物，其中R7是Cu杂芳烷基。
16.权利要求15所述的化合物，其中R7选自2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基。
17.权利要求4所述的化合物，其中Q不存在，L为S02。
18.权利要求17所述的化合物，其中R7选自C^6烷基和CV6芳烷基。
19.权利要求18所述的化合物，其中R7为Cu烷基。
20.权利要求19所述的化合物，其中R7为甲基。
21.权利要求18所述的化合物，其中R7为Cu芳烷基。
22.权利要求21所述的化合物，其中R7为苯基。
23.权利要求4所述的化合物，其中L为C=0。
24.权利要求23所述的化合物，其中R7选自氢、CV6烷基、CV6烯基、CV6炔基、芳基、CV6芳烷基、杂芳基、CV6 杂芳烷基、R8ZA-Cp8 烷基-、R11Z-Cp8 烷基-、(R8O) (R9O) P (=0) O-C1^8 烷基-ZAZ-C1-S 烷基-、(R8O) (R9O) P (=0) O-C1-S 烷基-Z-C卜8 烷基-、R8ZA-C卜8 烷基-ZAZ-C1^ 烧基 _、杂环基 MZAZ-Cb 烷基 _、(R8O) (R9O) P (=0) O-C1^8 烷基-、(Riq) 2N_Q_8 烷基-、(R10)3N+-C1^8烷基_、杂环基M-、碳环基M-、R11SO2C1^8烷基-和R11SO2NH ;或 R6和R7共同为Cp6烷基-Y-Cp6烷基、Cp6烷基-ZA-Cp6烷基、A-Cp6烷基-ZA-Ch烷基、A-Cp6烷基-A或Cp6烷基-A,由此形成环； 且Z和A的每个存在是独立的，不为共价键。
25.权利要求24所述的化合物，其中Q不存在。
26.权利要求25所述的化合物，其中R6和R7为CV6烷基。
27.权利要求26所述的化合物，其中R7选自乙基、异丙基、2，2，2-三氟乙基和2_(甲磺酰基)乙基。
28.权利要求25所述的化合物，其中R7为Cu芳烷基。
29.权利要求28所述的化合物，其中R7选自2-苯乙基、苯甲基、(4-甲氧苯基)甲基、(4-氯苯基)甲基和(4-氟苯基)甲基。
30.权利要求25所述的化合物，其中R6为C^6烷基，R7为芳基。
31.权利要求30所述的化合物，其中R7为取代的或未取代的苯基。
32.权利要求24所述的化合物，其中Q不存在或O，R7为碳环M-。
33.权利要求32所述的化合物，其中碳环为环丙基或环己基。
34.权利要求25所述的化合物，其中R7选自R8ZA-CV8烷基_、RnZ-CV8烷基_、(R8O)(R9O) P (=0) O-Ch 烷基-ZAZ-Ch 烷基 _、(R8O) (R9O) P(=0) O-CV8 烷基-Z-C1^8 烷基-、R8ZA-C^8烷基-ZAZ-C^8 烷基 _、杂环基 MZAZ-CV8 烷基 _、(R8O) (R9O) P (=0) O-C1^8 烷基-、A 为 C=0，Z 为O 或 NH。
35.权利要求34所述的化合物，其中Z为O。
36.权利要求35所述的化合物，其中R7为杂环基MZAZ-Cm烷基_，且杂环基为氧代二氧杂环戊烯基或N(R12) (R13)，其中R12和R13共同为CV6烷基-Y-Ch烷基，由此形成环。
37.权利要求36所述的化合物，其中R7选自(Rltl)2N-CV8烷基-和(R10)3N+(CH2)n-,R10为Cm烷基。
38.权利要求25所述的化合物，其中R7选自杂环基M-，杂环基选自吗啉代、哌啶子基、哌嗪子基、吡咯烷子基。
39.权利要求24所述的化合物，其中Q为O或NH。
40.权利要求39所述的化合物，其中R6为Cu烷基，R7选自CV6烷基、CV6芳烷基和C^6杂芳烷基。
41.权利要求40所述的`化合物，其中R7选自甲基、乙基、异丙基、苯甲基和(4-吡啶基)甲基。
42.权利要求24所述的化合物，其中R6和R7共同为CV6烷基-Y-Ch烷基、C1^6烷基-ZA-Ch烷基或Cu烷基-A，由此形成环。
43.权利要求42所述的化合物，其中L为C=0，Q和Y不存在，R6和R7共同为C^3烷基-Y-Cp3烷基。
44.权利要求42所述的化合物，其中L和Q不存在，R6和R7共同为C^3烷基-Y-C1I烷基。
45.权利要求42所述的化合物，其中L为C=0，Q不存在，Y选自NH和N-Ch烷基，R6和R7共同为C1^烷基-Y-C^3烷基。
46.权利要求42所述的化合物，其中L为C=0，Y不存在，R6和R7共同为k烷基-Y-C^3烷基。
47.权利要求42所述的化合物，其中L和A为C=0，R6和R7共同为C^2烷基-ZA-C^2烷基。
48.权利要求42所述的化合物，其中L和A为C=0，R6和R7共同为C2_3烷基-A。
49.具有式II结构的化合物或其药学上可接受的盐，
50.具有式(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐，
51.一种药物组合物，包括权利要求1或50所述的化合物和药学上可接受的载体。
52.一种抑制N-端亲核水解酶的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
53.一种治疗炎症的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
54.一种抑制或减轻H IV感染的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
55.一种治疗神经变性疾病的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
56.一种治疗肌肉萎缩病的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
57.一种治疗癌症的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
58.一种治疗慢性传染病的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
59.一种治疗发热的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
60.一种治疗免疫相关性病症的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
61.一种治疗去神经或神经损伤的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
62.一种影响个体中病毒基因表达水平的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的化合物。
63.—种改变生物体中蛋白酶体产生的抗原肽品种的方法，包括给予治疗有效量的权利要求I所述的化合物。`
【文档编号】C07K5/08GK103554222SQ201310512372
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2005年4月14日 优先权日:2004年4月15日
【发明者】M.S.史密斯, G.J.莱迪, R.T.波尔查德特, B.A.布宁, C.M.克鲁斯, J.H.穆塞尔, J.C.查巴拉 申请人:欧尼斯治疗公司