专利名称：稠合异吲哚酮作为蛋白激酶c抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及稠合的芳基和杂芳基稠合的异吲哚-2-和-2,4-二酮，这里称之为“稠合的异吲哚酮”。本发明也涉及制备这些化合物的方法，和应用这些化合物的方法。发明背景这里引用的出版物作为参考文献。
称之为“K-252a”的微生物产生的物质由于其所具有的多种功能活性而在过去的几年里引起广泛关注。K-252a是一种最初从Nocordiosis sp.培养物分离出来的吲哚并咔唑生物碱(Kase,H等，39，抗生素杂志(J.Antibiotics)1059,1986)。K-252a是一种几种酶包括蛋白激酶C(“PKC”)和trk酪氨酸激酶的抑制剂。报道的K-252a的功能活性是多种多样的，例如，肿瘤抑制作用(美国专利4877776和5063330；欧洲公开238011，名称是Nomato)；抗昆虫活性(美国专利4735939)；抑制炎症(美国专利4816450)；治疗与神经元细胞相关的疾病(WIPO公开WO94/02488,1994年2月3日公开，名称为Cephalon,Inc.和Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.)。
报道的吲哚并咔唑类具有几个共同的特性。特别是每个吲哚并咔唑包含一个双吲哚杂环部分。星形孢菌素(由链霉菌属(Streptomyces sp.)产生)和K-252a(由Nocordiosis sp.产生)各自进一步包括通过两个N-糖苷键(与吲哚氮原子连接)连接的糖部分。对于K-252a和星形孢菌素两者作为治疗剂的应用已进行了广泛的研究。吲哚并咔唑类一般是亲脂的，这使得它们相对比较容易与生物膜交叉反应，而且不象蛋白质材料，它们表现为更长的体内半衰期。
尽管K-252a具有如此多样和有用的活性，但是该化合物的缺点是因为其是微生物来源的，因此其一定是通过发酵方法从培养基中产生。最近文献中已经报道了K-252a的全合成方法，但是该合成对于商业应用是没有实效的(Wood,J等，J.Am.Chem.Soc.,1995,117,10413)。因此，具有所需的K-252a功能活性而又可使用化学合成技术容易获得的化合物将会提供比目前得到的吲哚并咔唑化合物特殊的优点。发明概述本发明的特征化合物是这里称之为“稠合异吲哚酮”的化合物。这些化合物是生物活性的。稠合异吲哚酮是可以从头化学合成的不包含吲哚的分子。
本发明稠合的异吲哚酮类与吲哚并咔唑的不同之处在于它们在12-或13-位不包含氮原子(Porter等，57 J.Org.Chem.2105,1992中提出的按字母顺序标记的环用于参考目的)。另外，稠合异吲哚酮不包括通过两个N-糖苷键连接的糖部分。因为这些化合物不包括这样一个糖部分，所以可以容易进行合成。有益且令人惊奇的是，这些不是来源于微生物的不包含吲哚的化合物可容易地合成，而且它们具有的生物活性使它们能在宽范围内应用，这些应用从前只在某些吲哚并咔唑类中发现。
本发明稠合的异吲哚酮用下面的通式(式Ⅰ)代表
优选的稠合异吲哚酮用式Ⅱ代表
结构组成在下面详细说明。在式Ⅰ和式Ⅱ两者中，在C环和E环中，成分“X”不是氮原子。
合成的优选途径也在这里说明，包括制备内酰胺异构体的方法。
本发明稠合的异吲哚酮类可有多方面作用，例如提高神经元谱系的细胞的功能和/或存活力，该细胞无论是单一的或者与神经营养因子和/或吲哚并咔唑结合的；抑制蛋白激酶C(PKC)；和抑制trk酪氨酸激酶活性。后一种活性指抑制癌细胞增殖包括前列腺癌病变的用途。因为这些多样化的活性，发现本发明化合物具有多方面用途，包括在研究和治疗方面的用途。详细说明Ⅰ．附图的简要说明
图1是证明稠合的异吲哚酮衍生物Ⅰ-1和Ⅰ-2对脊髓ChAT活性作用的曲线图。
图2是证明稠合的异吲哚酮促进基础前脑中ChAT活性的曲线图。
图3是合成双茚衍生物的流程图。
图4是合成稠合异吲哚酮的流程图。
图5是合成其中X是-C(=O)-的稠合异吲哚酮的流程图。
图6是由1-二氢茚酮合成稠合异吲哚酮(X=羰基)的流程图。
图7是合成包含两个羰基的稠合异吲哚酮的流程图。
图8是用米歇尔反应合成稠合异吲哚酮的流程图。
图9是用维蒂希反应合成选择的稠合异吲哚酮的流程图。
图10是合成X-双烷基化的稠合异吲哚酮的流程图。
图11是合成B环杂环稠合的异吲哚酮的流程图。
图12是合成B环和F环双杂环稠合的异吲哚酮的流程图。
图13是合成双苯并噻吩衍生物的流程图。
图14是合成茚基苯并噻吩衍生物的流程图。
图15是用狄尔斯-阿尔德反应用乙炔二羧酸酯合成稠合异吲哚酮的流程图。Ⅱ．稠合异吲哚酮本发明特征在于式Ⅰ代表的稠合异吲哚酮其中
B环和F环独立地选自下面的组(a)其中最多3个碳原子被氮原子置换的6-元芳香碳环；(b)5-元芳香碳环；和(c)5-元芳香碳环，其中(1)一个碳原子被氧原子，氮原子，或硫原子置换；或者(2)两个碳原子被一个氮原子和一个硫原子，或一个氮原子和一个氧原子置换；R1选自H,1-4碳原子烷基；芳基；芳基烷基；杂芳基；杂芳基烷基；COR9，其中R9选自1-4碳原子烷基，芳基和杂芳基；-OR10，其中R10选自H和1-4碳原子烷基；-CONH2,-NR7R8,-(CH2)nNR7R8，和-O-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4，和(a)R7和R8独立地选自H和1-4碳原子烷基；或(b)R7和R8一起形成式-(CH2)2-X1-(CH2)2-连接基团，其中X1选自-O-,-S-，和-CH2-；A1和A2双双选自H,H；H,-OR11，其中R11是H,1-4碳原子烷基，6-10碳原子芳基，或杂芳基；H,-SR11；H,-N(R11)2；=O；=S；和=NR11，其中A1和A2一起代表双键键合的原子；B1和B2双双选自H,H；H,-OR11；H,-SR11；H,-N(R11)2；=O；=S；和=NR11，其中B1和B2一起代表双键键合的原子；前提是A1和A2，及B1和B2对中的至少一个是=O；在每个位置上的X独立地选自下组(a)未取代的1-3碳原子亚烷基；(b)R2取代的1-3碳原子亚烷基，其中R2选自下组(1)OR10；-SR10；R15，其中R15是1-4碳原子烷基；苯基；萘基；7-15碳原子芳基烷基；H；-SO2R9；-CO2R9；-COR9；1-8碳原子烷基，链烯基和炔烃基，其中
(ⅰ)1-8碳原子每一烷基，链烯基或炔基是未取代的；或(ⅱ)1-8碳原子的每一烷基，链烯基或炔基是被一个取代基取代的，代基选自1-3个6-10碳原子芳基；杂芳基；F；Cl；Br；I；-CN-NO2；OH；-OR9；-O-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4；-OCOR9；-OCONHR9；四氢吡喃基；NH2；-NR7R8；-NR10COR9；-NR10CO2R9；-NR10CONR7R8；-NHC(=NH)NH2；-NR10SO2R9；-S(O)yR11，其中y是1或2；-SR11；-CO2R9；-CONR7R8；-CHO；COR9；-CH2OR7；-CH=NNR11R12，其中R12选自H,1-4碳原子烷基；6-10碳原子芳基，和杂芳基；-CH=NOR11；-CH=NR9；-CH=NNHCH(N=NH)NH2；-SO2NR12R13，其中R13选自H,1-4碳原子烷基；6-10碳原子芳基，和杂芳基；或者R12和R13一起形成一个连接基团；-PO(OR11)2,-OR14，其中R14是羧基中的羟基去除后的氨基酸残基；或者(2)5-7碳原子单糖，其中单糖的各羟基独立地是未取代的或者被H,1-4碳原子烷基，2-5碳原子烷基羰基氧基或1-4碳原子烷氧基置换；和(c)选自下组的官能团-CH=CH-；-CHOH-CHOH-；-O-；-S-；-S(=O]-；-S(S=O)2-；-C(R10)2-；-C=C(R2)2；-C(=O)-；-C(=NOR11)-；-C(OR11)(R11)-；-C(=O)CH(R15)-；-CH(R15)C(=O)-；-C(=NOR11)CH(R15)-；-CH(R15)C(=NOR11)-；CONR15；NR15CO；-CH2Z-，其中Z是-CR11；-Z-CH2-；-CH2ZCH2-；-O-；-S-；-C(=O)OR11；-C(=NOR11)；和-NR11；R3,R4,R5和R6各自独立地选自H；芳基；杂芳基；F；Cl；Br；I；-CN；CF3；-NO2；OH；-OR9；-O(CH2)nNR7R8；-OCOR9；-OCONHR9；NH2；-CH2OH；-CH2OR14；-NR7R8；-NR10COR9；-NR10CONR7R8；-SR11；-S(O)yR11，其中y是1或2；-CO2R9；-COR9；-CONR7R8；-CHO；-CH=NOR11；-CH=NR9；-CH=NNR11R12；-(CH2)nSR9，其中n是1-4；-(CH2)nS(O)yR9；-CH2SR15，其中R15是1-4碳原子烷基；-CH2S(O)YR14；-(CH2)nNR7R8；-(CH2)nNHR14；1-8碳原子烷基，链烯基，炔烃基，其中(a)1-8碳原子每一烷基，链烯基或炔烃基是未取代的；或
(b)1-8碳原子每一烷基，链烯基或炔烃基被下面的基团取代1-3个6-10碳原子芳基；杂芳基；F；Cl；Br；I；-CN；-NO2；OH；-OR9；-O-(CH2)nNR7R8；-OCOR9；-OCONHR9；O-四氢吡喃基；NH2；-NR7R8；NR10COR9；-NR10CO2R9；-NR10CONR7R8；-NHC(=NH)NH2；-NR10SO2R9；-S(O)yR11，其中y是1或2；-SR11；-CO2R9；-CONR7R8；-CHO；COR9；-CH2OR7；-CH=NNR11R12；-CH=NOR11；-CH=NR9；-CH=NNHCH(N=NH)NH2；-SO2NR12R13；-PO(OR11)2；-OR14；或5-7碳原子单糖，其中单糖的各羟基独立地是未取代的或者被H,1-4碳原子烷基，2-5碳原子烷基羰基氧基或1-4碳原子烷氧基置换。本发明优选的实施方案是式Ⅱ代表的稠合的异吲哚酮类
优选的是，A1和A2双双选自H,H；H,-OH，和=O；B1和B2双双选自H,H；H,-OH，和=O；前提是A1和A2，或B1和B2是=O。
R1优选是H。当R1是COR9且R9是芳基时，R9优选是苯基或萘基。
优选的是，X在任一位置或者在两个位置是未取代的1-3碳原子亚烷基，-O-，或-S-。当X具有R2取代基时，优选的R2基团是OR10。当R2基团是7-14碳原子芳基烷基时，其优选是苄基。当R2是烷基，链烯基，或炔基时，其优选是1-4碳原子烷基，链烯基，或炔基。当R2是取代的烷基，链烯基，或炔基时，取代基是芳基，芳基优选是苯基或萘基。当R2上的取代基是-S(O)yR11，且R11是芳基时，R11优选是苯基或萘基。当R2上的取代基是-CH=NNR11R12或-SO2NR12R13，且R12或R13是芳基时，它优选是苯基或萘基。当R12和R13一起代表一个连接基团，优选该连接基团是-(CH2)2-X1-(CH2)2-，其中X1选自-O-；-S-；和-CH2-。
优选的是R3,R4,R5，和R6是H。当R3,R4,R5，和R6中至少一个是芳基时，其优选是6-10碳原子芳基，更优选是苯基或萘基，前提是R3或R4是H,R5或R6是H。当R3,R4,R5，和R6中至少一个是1-8碳原子烷基，链烯基，或炔基时，其优选是1-4碳原子烷基，链烯基，或炔基，前提是R3或R4是H,R5或R6是H。
这里各处所定数值范围是包括两个端点的。例如“1-4碳原子”包括值1、2、3、和4个碳原子。除非另有说明，这里各处所使用的术语“芳基”或“杂芳基”是理解为可以被取代的或未取代的芳基或杂芳基。
定义R14所使用的术语“氨基酸”指含有氨基和羧基两者的分子。它包括“α-氨基酸”，其通常的意义是在与羧基紧邻的碳原子上具有一个氨基官能团的羧酸。α-氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。氨基酸也包括“二肽”，这里定义为通过肽键连接的两个氨基酸。因此二肽的组成不只限于α-氨基酸，还可以是含有氨基和羧基两者的任何分子。优选的是α-氨基酸、二肽例如赖氨酰-β-丙氨酸、和2-8碳原子氨基链烷酸，例如3-二甲基-氨基丁酸。
稠合异吲哚酮衍生物的药学可接受盐也落在本发明公开的化合物范围内。这里所定义的术语“药学可接受盐”指无机酸加成盐例如盐酸盐，硫酸盐，和磷酸盐，或者有机酸加成盐例如乙酸盐，马来酸盐，富马酸盐，酒石酸盐，和柠檬酸盐。药学可接受金属盐的例子是碱金属盐例如钠盐和钾盐，碱土金属盐，例如镁盐和钙盐，铝盐，和锌盐。药学可接受铵盐的例子是铵盐和四甲基铵盐。药学可接受有机胺加成盐的例子是与吗啉和哌啶加成的盐。药学可接受氨基酸加成盐的例子是与赖氨酸，甘氨酸，和苯丙氨酸的盐。
本发明提供的化合物可以通过与药学可接受的无毒性赋形剂和载体混合而配制成药物组合物。如上面所指出的，这样的组合物可以制成肠胃外给药，特别是以液体溶液或悬浮液形式；或者口服给药，特别是以片剂或胶囊形式；或者鼻内给药，特别是以粉末剂，鼻滴剂，或气雾剂的形式；或者皮肤给药，例如透皮给药。
该组合物可以以单位剂量形式常规给药，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton.PA,1980)中所描述的。用于肠胃外给药的制剂可以含有作为常规赋形剂的无菌水或盐水，聚亚烷基二醇例如聚乙二醇，油和植物源，氢化的萘等等。特别是，生物相容的生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可是控制活性化合物释放的有用的赋形剂。这些活性化合物的其它有效的用于肠胃外运送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒剂、渗透汲送剂、植入灌注、和脂质体。吸入法给药的制剂含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含水溶液，其含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和去氧胆酸盐，或者是以鼻滴剂形式，或者作为鼻内施用的凝胶形式给药的油性溶液。肠胃外给药的制剂还可以包括颊服的甘胆酸盐、用于直肠给药的水杨酸盐、或用于阴道给药的柠檬酸。用于经皮膜的制剂优选是亲脂的乳液。
本发明物质可以用作药物中的单一的活性剂，或者可以与其它活性成分例如其它生长因子结合使用，以便有利于疾病或症状中神经元存活或轴突的再生、癌症治疗或HIV感染治疗。
这里所描述的化合物在治疗剂中的浓度取决于多种因素，包括要给药的药物的剂量、所用化合物的化学特性(例如疏水性)、和给药途径。在一般情况下，本发明化合物可以在含有大约0.1-10％w/v化合物的含水生理缓冲液中提供用于肠胃外给药。一般的剂量范围是每天大约1μg/kg体重至大约1g/kg体重，优选的剂量范围是每天大约0.01mg/kg体重至100mg/kg体重。用药的优选剂量可能取决于这样一些不定因素，如疾病或症状的类型和程度，患者总的健康状况，所选择的化合物和该化合物赋形剂配制的相关生物效能，以及给药途径。Ⅲ．稠合异吲哚酮的用途已经证实稠合异吲哚酮的功能药理活性具有多种重要的用途，包括在研究和医疗领域。一般情况下，稠合异吲哚酮的活性对营养因子效应性细胞的功能和/或存活显示出正作用，并证明了酶活性即trk和PKC的抑制作用。
对营养因子效应性细胞(例如神经元谱系细胞)的功能和/或存活的作用可以用下面的任何一种测试证明(1)培养的脊髓胆碱乙酰转移酶(“ChAT”)测试；或(2)培养的基础前脑神经元(“BFN”)ChAT活性测试。酶活性的抑制作用可以用PKC抑制测试和trk酪氨酸激酶抑制测试来测定。
这里使用的术语“作用”当用来修饰术语“功能”和“存活”时指正的或负的改变或变化。正作用在这里是指“增强作用”或“增强”，负作用在这里是指“抑制作用”或“抑制”。
这里所使用的术语“增强”当用来修饰术语“功能”和“存活”时是指有稠合异吲哚酮存在的细胞与没有稠合异吲哚酮存在下的细胞相比对营养因子效应性细胞的功能和/或存活有正作用。例如(不作为限制)，关于胆碱功能的神经元的存活，如果治疗的种群比没有治疗的种群有更长功能期，则当与没有存在这种稠合异吲哚酮的胆碱功能神经元的种群相比，稠合异吲哚酮明显增强在有死亡危险时(例如由于损伤，疾病，退化或自然恶化)胆碱功能神经元种群的存活。
这里所使用的“抑制”和“抑制作用”是指所用材料的特异效应(例如酶活性)在稠合异吲哚酮存在下相对降低。
这里使用的术语“神经元”，“神经元谱系细胞”和“神经元细胞”包括(但不限于)一种异源种群的神经元类型，具有单一或多介质和/或单一或多功能神经元；优选是胆碱功能的和感觉的神经元。这里使用的术语“胆碱功能神经元”指神经介质是乙酰胆碱的中枢神经系统(CNS)和末梢神经系统(PNS)神经元；例子是基础前脑和脊髓神经元。这里使用的术语“感觉神经元”包括例如来自皮肤、肌肉和关节的对周围环境(例如温度，运动)有反应的神经元；例子是来自DRG的神经元。
这里定义的“营养因子效应性细胞”是包括营养因子可以特异性结合的受体的细胞；例子包括神经元(例如胆碱功能的和感觉的神经元)和非神经元细胞(例如单核细胞和致瘤性细胞)。
这里使用的术语“trk”指一类高亲和性神经营养蛋白受体，现在包括trkA,trkB，和trkC，及一种神经营养蛋白可以结合的其它膜相关的蛋白质。A．对营养因子效应细胞功能和/或存活的作用本发明的稠合异吲哚酮可以用来增强神经元谱系细胞的功能和/或存活。在本文中，稠合异吲哚酮可以单独使用或者与其它的稠合异吲哚酮一起使用，或者与其它有效的分子(例如也能影响该细胞功能和/或存活能力的吲哚并咔唑)结合使用。
多种神经性疾病的特征表现在将要死亡、损伤的神经元细胞上，功能上包括在临濒死亡时发生进行性中枢神经退化等。这些疾病包括但不限于阿耳茨海默氏病；运动神经元疾病(例如肌萎缩性侧索硬化-ALS)；帕金森病；脑血管疾病(例如中风，局部缺血)；亨廷顿舞蹈病，爱滋病痴呆；癫痫；多发性硬化；末稍神经病(例如那些在化疗相关的末梢神经病中影响DRG神经元的疾病)包括糖尿病性神经病；兴奋性氨基酸诱导的疾病；与脑或脊髓震荡或穿透损伤相关的疾病。
如说明书实施例部分所提出的稠合异吲哚酮增强神经元谱系细胞的功能和/或存活的能力可以用下面的任一种测试方法测定性(1)脊髓ChAT活性测试法；或(2)基础前脑ChAT活性测试法。
ChAT催化神经介质乙酰胆碱的合成并被认为是功能性胆碱能神经元的酶标物。功能神经元也能存活。神经元存活是通过活神经元引起的一种染料(例如钙黄绿素AM)的特异性摄入和酶转化的定量来测定。
因为稠合异吲哚酮有各种不同的用途，本发明找到的用途也是各不相同的。这些化合物可以用于开发神经元细胞存活、功用、鉴定的体外模型，或者用于筛选具有与稠合异吲哚酮相似活性的其它合成的化合物。这些化合物可以用于研究、定义和测定与功能效应相关的分子靶物的研究领域。例如，通过放射标记一种与特定细胞功能(例如细胞分裂)相关的稠合异吲哚酮，可以鉴定、分离、和纯化与该稠合异吲哚酮结合的靶物实体来达到表征的目的。
神经元的退化、死亡或丧失功能是很多人神经学疾病的特征，包括但不限于阿耳茨海默氏病；运动神经元疾病(例如ALS)；帕金森病；脑血管疾病(例如中风，局部缺血)；亨廷顿舞蹈病，爱滋病痴呆；癫痫；多发性硬化；脑或脊髓震荡或穿透损伤；末梢神经病；和兴奋性氨基酸诱导的疾病。因为本发明公开的化合物已经证实在例如ChAT活性增强中的用途，因此该化合物在治疗与例如降低ChAT活性或DGR神经元细胞死亡相关的疾病中的用途也在本发明范围内。实施例Ⅲ(A)(1)脊髓ChAT活性测试正如所指出的那样，ChAT是功能性胆碱能神经元的特异性生物化学标记。胆碱功能神经元代表进入海马形成、嗅觉细胞核、脑脚间核、皮质、苦扁桃、和脑丘部分的主要胆碱功能。在脊髓中，运动神经元是含有ChAT的胆碱功能神经元(Phelps等，J.Comp.Neurol.273:459-472(1988))。ChAT活性已被用来研究神经营养蛋白(例如NGF或NT-3)对胆碱功能神经元存活和/或功能的作用。ChAT测试也作为胆碱功能神经元内ChAT水平的调节作用的一种指示。
稠合异吲哚酮衍生物在分离的大鼠胚胎脊髓培养物测试中提高了ChAT活性(图1)。化合物Ⅰ-2在细胞放在对照组织培养物孔中2-3小时平板培养周期后使ChAT活性超过对照培养物(没有用稠合异吲哚酮处理)150％。在这些测试中，稠合异吲哚酮被直接加到分离的脊髓培养物中。本发明化合物提高了脊髓ChAT活性。将ChAT活性提高至少是对照活性120％的化合物被认为是有活性的。单一应用稠合异吲哚酮后观察到ChAT活性提高。该化合物在脊髓细胞培养物起初分离的当天加入。48小时后ChAT活性提高是可检测到的。
方法分离大鼠胚胎的脊髓细胞，并根据文献说明(Smith等，细胞生物学杂志(J.Cell Biology)101:1608-1621(1985)；Glicksman等，神经化学杂志(J.Neurochem.)61:210-221(1993))进行试验。通过标准的胰蛋白酶分离技术(Smith等，细胞生物学杂志(J.Cell Biology)101:1608-1621(1985)从由大鼠(胚胎14-15天)切片下来的脊髓制备分离的细胞。细胞以6×105个细胞/cm2的密度铺在包被聚-1-鸟氨酸的塑料组织培养孔中，在补充有0.05％牛血清白蛋白(BSA)的没有血清的N2培养基中进行平板培养(Bottenstein等，PNAS USA76:514-517(1979))。培养物在37℃在5％CO2/95％空气的湿润气氛下保温48小时。2天后在体外用McManaman等和Glicksman等改进的Fonnum方法(Fonnum，神经化学杂志(J.Neurochem.)24:407-409(1975))测定ChAT活性(McManaman等，生物学进展(Developmental Biology)125:311-320(1988)；Glicksman等，神经化学杂志(J.Neurochem.)61:210-221(1993))。实施例Ⅲ(A)(2)基础前脑ChAT活性测试对稠合异吲哚酮衍生物提高基础前脑培养物ChAT活性的能力作了测试。发现稠合异吲哚酮提高了基础前脑培养物ChAT活性(图2)。对照培养物没有接受稠合并吲哚酮。
在基础前脑ChAT活性的预测试中，化合物Ⅰ-3和Ⅰ-4没有提高ChAT活性。
方法从大鼠胚胎(17或18天胚胎)切片下来基础前脑，并用神经蛋白酶(DispaseTM,Collaborative Research)分离细胞。神经元以5×104个细胞/孔(1.5×105个细胞/cm2)的密度在聚-1-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的平板中平板培养。细胞在含有0.05％BSA的没有血清的N2培养基中在37℃5％CO2/95％空气的湿润气氛下培养。通过应用实施例Ⅲ(A)(1)中描述的ChAT测试法在平板培养5天后测定ChAT活性。
B．酶活性的抑制作用吲哚并咔唑K-252a抑制PKC的酶活性的能力是公知的并有文献报道。人们提议PKC活性的抑制作为抑制、介导、减少和/或防止各种各样疾病的途径，包括炎性疾病，变态反应和癌症，正如下面代表性文献中所指出的那样，这些文献是美国专利4877776和4923986；公开的欧洲专利说明书558962(1993年9月8日公开，E.R.Squibb & Sons,Inc)；Tadka,T.等，170(3)生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)1151,1980。try是酪氨酸激酶中的一员，催化ATPγ-磷酸盐转移到很多关键蛋白质上酪氨酸羟基的酶是酪氨酸激酶。激活的蛋白质酪氨酸激酶已经鉴定为是大约一半的已知癌基因产物(参见Chang,C-J & Geahlen,R.L.55(11)J.Nat.Prods.1529,1992)。已经提出了通过抑制蛋白激酶来抑制、介导、减少和/或防止各种各样癌症(参见Chang,C-J上文)。
由于蛋白激酶活性和一些疾病和病症(例如癌症)之间重要的联系，使稠合异吲哚酮在研究和治疗领域也找到了用途。例如，在研究方面，本发明化合物可以用于开发测试方法和模型以便进一步提高对蛋白激酶(例如，PKC,try酪氨酸激酶)的抑制在相关疾病和病症的机理方面所起作用的认识。在治疗方面，抑制这些酶活性的化合物可以用来抑制这些酶对于一些疾病(例如癌症)的有害结果。
根据下面测试的测定数据证明了使用稠合异吲哚酮对酶活性的抑制作用(1)PKC活性抑制作用测试；(2)tryA酪氨酸激酶活性抑制作用测试。实施例Ⅲ(B)(1):PKC活性抑制作用测试稠合异吲哚酮抑制蛋白激酶C的活性(表Ⅵ)。蛋白激酶C测试已经公开(Murakata等，美国专利4923986；Kikkawa等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)257:13341-13348(1982))。该测试是用几种浓度的稠合异吲哚酮进行的。对蛋白激酶C被抑制50％时的浓度(IC50)作了测定。表Ⅰ蛋白激酶C抑制作用
实施例Ⅲ(B)(2):tryA酪氨酸激酶活性抑制作用测试稠合异吲哚酮抑制tryA酪氨酸激酶活性根据ELISA测定。tryA是神经营养蛋白高亲和性受体。向预先包被磷酸化作用底物(磷脂酶C-γ(PLCγ)/pGEX融合蛋白)(参见Rotin等，11EMBO J.559,1992)的96孔微量滴定平板加入稠合的异吲哚酮。然后测试这些化合物抑制由tryA酪氨酸激酶引起的底物磷酸化作用的能力。表Ⅱ:tryA酪氨酸激酶活性的抑制作用
方法96-孔ELISA平板(Nunc)包被有100μl/孔磷酸化作用底物(40μg/mlPLVγ/pGEX融合蛋白)，在4℃下在20mM Tris,pH7.6,137mM NaCl，和0.02％NaN3中过夜。然后将这些平板用TBST(20mM Tris,pH7.6,137mMNaCl，和0.2％吐温-20)洗涤3次，并接着在TBST中3％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭1小时。平板用TBST洗涤3次，并接着用TBS(TBSTsans吐温-20)洗涤两次。然后将不同浓度的稠合吡咯并咔唑加到反应混合物中(50mMHEPES,pH7.4,5mM MnCl2,5mM MgCl2,140mM NaCl,16μM ATP和15ng tryA，总体积是100μL)。作为负对照，反应溶液中包括100mMEDTA。然后平板在37℃保温15分钟。检测抗体，单克隆抗磷酸酪氨酸抗体(UBI)以在TBST中1∶2000的稀释度稀释，并在37℃保温1小时。然后平板用TBST洗涤3次，接着与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(在TBST中(Bio-Rad)1∶2000)在37℃保温1小时。用TBST洗涤3次后，接着用TBS洗涤两次，通过使用NADPH作为碱性磷酸酶的底物，和心肌黄酶与醇脱氢酶的偶联反应(GIBCO-BRL ELISA扩增系统)制备有色产物。在微板读数器(Biotek)中在490nm读到有色产物。Ⅳ．合成方法的一般说明本发明化合物通过下面描述的一般方法来制备。图3概述了其中X=CH2,CH2的化合物。已知的该2-2’联茚(3,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(2))通过钯催化的2-(三丁基甲锡烷基)茚(2)与2-溴代茚(1)偶联的改进的方法来制备。使用文献方法(有机化学(J.Org.Chem.),1982,47,705)制备的2-溴代茚(1)被用来制备2-(三丁基甲锡烷基)茚(2)(实施例Ⅳ(1))(图3)。芳基取代的2-溴代茚可以从茚或者1-或2-二氢茚酮由有机合成领域技术人员制备。
通式3化合物与马来酰亚胺的环加成反应优选在160-200℃温度下进行(方法1)生成相应的四氢异吲哚基-二酮(4,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(3))。先前没有公开过2-(2-茚基)茚的环加成反应。二烯与马来酰亚胺的环加成反应是公知的(参见，例如J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,1990,2475)。实施例Ⅳ(3)的脱氢是根据常规方法，使用例如2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯并醌，活性炭上的钯，硫或亚硝酸钠(美国专利4912107和这里所引的参考文献)，得到相应的芳构化异吲哚酮-酰亚胺衍生物5(实施例Ⅳ(4))(Ⅰ-1化合物，R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H)。通式6的内酰胺(实施例Ⅳ(5),Ⅰ-2化合物，R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H)可以通过用还原剂(例如锌汞齐、氯化氢气体、乙酸中的锌汞齐、冰醋酸中的锌、或氢化物还原剂例如氢化锂铝)还原酰亚胺5而制备。其中R2,R3,R4,R5或R6不是氢的情况下，生成内酰胺区域异构体(通式6和7)。内酰胺区域异构体可以通过标准方法分离，例如重结晶或色谱法，例如柱色谱或HPLC。酰亚胺可以被氢化物还原剂例如氢硼化物或氢铝化物(美国专利4192107和4923986和这里所引的文献)还原成其中A1,A2或B1,B2=H,OH的羟基内酰胺(8，图3)。得到的羟基容易转化成烷氧基或硫代烷基(美国专利4923986)。其中A1,A2或B1,B2一起代表S或N的衍生物根据欧洲专利申请No.0508792AI所述制备。
在方法Ⅱ中(图15)，适当的二烯与乙炔二羧酸酯(R=低级烷基)的环加成反应得到相应的通式39芳香族化合物。异苯并呋喃(通式40)可以通过用亲核试剂(例如LiI,NaCN,NaSCH3,NaSCN等)将酯去烷基化，接着用乙酐形成酸酐而获得。通式41的酰亚胺可以通过式40的异苯并呋喃与，1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷和甲醇反应来制备(Tetrahedron Lett.1990,31,5201-5204)。通式42的内酰胺可以通过用还原剂(例如锌汞齐，氯化氢气体，乙酸中的锌汞齐，冰醋酸中的锌，或氢化物还原剂例如氢化锂铝)还原酰亚胺41来制备。其中R2,R3,R4,R5或R6不是氢，或者X基团不相同的情况下，生成内酰胺区域异构体(通式42和43)。内酰胺区域异构体可以通过标准方法分离，例如重结晶或色谱法，例如柱色谱或HPLC。酰亚胺可以根据先前描述被还原成羟基内酰胺(44，图15)。
具体地说，图13概述了其中X=S的化合物。根据对于化合物3所描述的相同方法制备2,2’-双-苯并噻吩(25,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ6))。通式25化合物与乙炔二羧酸二乙酯优选在180-200℃温度下的环加成反应生成相应的甲酰乙氧基二苯并噻吩(26,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(7))。先前没有公开过2,2’-双苯并噻吩的环加成反应。甲酰乙氧基二苯并噻吩可以通过用亲核试剂(例如LiI,NaCN,NaSCH3,NaSCN等)将酯去烷基化，接着用乙酐形成酸酐而转化成相应的异苯并呋喃(27,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(8))(方法Ⅱ)。通式28的酰亚胺((化合物Ⅰ-3),R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(9))可以根据上述(方法Ⅱ)所述通过异苯并呋喃27与1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷和甲醇反应来制备。通式29的内酰胺((化合物Ⅰ-4),R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(10))可以根据方法Ⅰ所述通过用还原剂还原酰亚胺28来制备。酰亚胺类可以根据先前说明还原成羟基内酰胺(30，图13)。
图14概述了不对称茚基苯并噻吩(X=S,CH2)的合成。通过先前对于3描述的方法制备2-(2’-茚基)苯并噻吩(31,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(11))。通式31化合物与乙炔二羧酸二乙酯的环加成反应生成相应的甲酰乙氧基二苯并噻吩(32,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(12))。甲酰乙氧基二苯并噻吩32可以根据先前描述通过用亲核试剂将酯去烷基化，接着用乙酐形成酸酐而转化成相应的异苯并呋喃(33,R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(13))。通式34的酰亚胺((化合物Ⅰ-5),R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(14))可以根据图13中的相同方法制备。通式35的内酰胺((化合物Ⅰ-6),R1,R2,R3,R4,R5,R6,=H；实施例Ⅳ(10))可以通过用还原剂(例如锌汞齐，氯化氢气体，乙酸中的锌汞齐，冰醋酸中的锌，或氢化物还原剂例如氢化锂铝)还原酰亚胺34来制备。其中R2,R3,R4,R5或R6不是氢的情况下，生成内酰胺区域异构体。内酰胺区域异构体可以通过标准方法分离，例如重结晶或色谱法，例如柱色谱或HPLC。酰亚胺可以根据先前描述被还原成羟基内酰胺(37，图14)。
其中X=CH2CH2，或CH=CH的通式Ⅱ的稠合异吲哚酮衍生物通过对于6或7描述的方法(图3)制备，除了用2-溴代-或2-(三丁基甲锡烷基)-3,4-二氢萘代替2-溴代茚和/或2-(三丁基甲锡烷基)茚(图4)。有机合成领域技术人员可以从1-或2-四氢萘酮制备芳基取代的2-溴代-3,4-二氢萘。用2-苯并环庚烯衍生物(J.Am.Chem.Soc.13:1344,(1991)；J.Org.Chem.44:1342(1979))代替茚衍生物得到其中X=CH2CH2CH2的式Ⅱ稠合异吲哚酮。其中X是C=O的酮衍生物可以通过使用标准氧化剂(例如，SeO2,CrO3,Na2CrO7，或MnO2)氧化酰亚胺(S)或内酰胺(6或7)来制备(图5)。或者，X=(C=O,H)衍生物(11)可以通过实施例Ⅳ(1)(图6)描述的方法，通过用可以用来制备2-(三丁基甲锡烷基)茚-1-酮(10)的2-溴代茚-1-酮(9)(J.Org.Chem.,1994,59,3453)起始来制备。类似地，X=(C=O,C=O)衍生物(12)可以通过使2-溴代茚-1-酮(9)与2-(三丁基甲锡烷基)茚-1-酮反应来制备(图7)。
其它X基团，例如X=S,O，或C=O的化合物(式Ⅱ)可以根据方法Ⅰ中说明的适当的二烯与马来酰亚胺的环加成反应(图4)或者通过对于方法Ⅱ说明的方法(图15)来制备。例如，2-(2-(1-氧代茚基))茚(X=(C=O),CH2),2,2’-(1-氧代)联茚(X=(C=O),(C=O)),2-(2-茚基)苯并噻吩(X=CH2,S),2-(2-茚基)苯并呋喃(X=CH2,O),2,2’-双-苯并噻吩(X=S,S),2-(2-苯并噻吩基)苯并呋喃(X=S,O)各自可以通过将相应的2-三丁基甲锡烷基衍生物与适当的2-溴代芳基或杂芳基衍生物偶联来制备。所需化合物的制备也可以在酸催化剂例如三氟乙酸，或路易斯酸(SnCl4,Et2AlCl)存在下用马来酰亚胺来处理(例如)2-(2-苯并噻吩基)苯并呋喃(X=S,O)或2-(2-苯并噻吩基)苯并噻吩(X=S,S)来实现，得到通式13化合物(图8)。通过用一种催化剂处理，例如用冰醋酸中的Pd(OAc)2或C2H4Cl2中Pd(OAc)2，四氯-1,4-苯并醌，将这些化合物环化生成相应的稠合异吲哚酮衍生物14(图8)。
有机合成领域技术人员公知的钯催化的交联方法被用来制备其它衍生物，例如通过将相应的环状酮的乙烯基-2-(三氟甲磺酸酯)衍生物，或者合适的芳基或杂芳基部分的2-三氟甲磺酸酯衍生物与先前描述的合适的锡衍生物偶联来制备其它衍生物，例如其中图8中X是1-3碳原子(包括1或3个碳原子)的化合物。
其中含有氮原子的R1是与氢键合的衍生物可以转化成对于式Ⅰ所描述的R1基团(美国专利No.4923986)。
其中R3,R4,R5或R6取代基不是氢的式Ⅰ衍生物用先前描述的方法通过用合适的取代的中间体起始，或者使用有机化学领域技术人员公知的官能团相互转化的标准方法来制备。
有机合成领域技术人员可以从对其中X=(C=O,C=O,H)的衍生物(图9)的Witting相关的烯化作用反应，生成带有R2取代的衍生物，其中X是双键键合的烯烃(式Ⅱ)。得到的烯烃(15)可以被还原成通式结构(16)的化合物(图9)。其中X=CH2的衍生物可以通过与强碱反应，(例如与BuLi,NaNH2或LiN(iPr)2)，接着用合适的亲电试剂处理而容易烷基化(J.Med.Chem.,1992,35,3919；J.Org.Chem.,1991,56,4499)(图10)。
其中B环和/或F环可以象上面对于E1和E2定义一样独立地包含氮环原子，氧环原子，或硫环原子的式Ⅰ稠合异吲哚酮可以通过用来制备碳环类似物的类似方法来制备(图11和图12)。
图11概述了其中B环是含氮原子6-元杂环的衍生物(氮原子可以在6个位置的任何位置上)的制备。通式化合物17与马来酰亚胺的环加成反应得到通式结构18的化合物。以类似于实施例Ⅳ(4)(图3)制备的方法将中间体18脱氢化，得到通式结构19酰亚胺衍生物(图11)。通式结构20的内酰胺异构体可以通过使通式结构19的酰亚胺衍生物与还原剂、例如锌汞齐-HCl、乙酸中的锌汞齐、或氢化物还原剂例如氢化锂铝反应来制备。区域异构体可以通过标准方法分离，例如重结晶或色谱法，例如柱色谱或HPLC。酰亚胺可以通过氢化物还原剂例如氢硼化物或氢铝化物还原成其中A1,A2或B1,B2=H,OH的羟基内酰胺。
其中B环或F环是含有氧原子或硫原子的5-元环的化合物可以分别用呋喃基-吡咯或噻吩并吡咯代替茚为起始物根据图3和4概述的合成方法制备。环稠合的呋喃基-吡咯可以使用先前建立的文献方法或其改进方法来制备(Coll.Czech.Chem.Commun.53:1770(1988)；Can.J.Chem.56:1429(1978)；C.R.Hebd.Seances.Acad.Sci.,Ser.C281:793(1975))。环稠合的噻吩基-吡咯可以使用先前建立的文献方法或其改进方法制备(Belgian专利说明书BE899925；Ind.J.Chem.20B:271(1981)；Can.J.Chem.56:1429(1978)；Bull.Soc.Chim.Fr.11-12,pt2:2511(1975)；C.R..Hebd.Seances Acad.Sci.,Ser.C277:1149(1973))。
另一方面，其中B环或F环含有氮环原子的化合物可以用环链烷酮稠合的吡啶衍生物(X=C1-C3亚烷基)起始制备。环链烷酮-吡啶衍生物的合成已经在文献中有所描述(J.Med.Chem.36:3381(1993),Chem Ber.,1970,103,2403)，这些化合物可以直接用来制备通式结构21或22的中间体(图12)。有机合成领域的技术人员可以将环稠合环烷基-或环链烷酮-吡啶衍生物转化成环乙烯基溴化合物。乙烯基溴中间体是进行图3和图4描述的锡交叉偶联方法合适的底物。
其中F环含有氧原子的化合物可以用呋喃基稠合的环链烷酮或环链烯基衍生物(X=C1-C3亚烷基)起始制备。其中F环含有硫成环原子的化合物可以用稠合的环链烯基-噻吩起始制备。环烷基环稠合的噻吩基或呋喃基衍生物可以使用先前文献描述的方法(Acta Chem.Scand.25:1287(1971)；J.Am.Chem.Soc.103:2760(1981))或其改进的方法制备。这些中间体可以转化成呋喃基-或噻吩基-环戊酮或呋喃基-或噻吩基-环戊烯。或者有机合成领域的技术人员可以将这些起始物转化成相应的环乙烯基溴化合物。这些乙烯基溴中间体可以用图3和图4描述的锡交叉偶联方法来给出需要的中间体。
如图12所示，B环和F环两者可以同时被杂原子取代。由杂原子取代的B环锡中间体22和F-环杂原子取代的环乙烯基溴化物21(或者相应的环酮中间体的triflate)可以形成中间体23。在B环和F环中含有杂原子的酰亚胺和内酰胺衍生物可以通过图3和图4所示的方法制备。或者可以使用图8描述的米歇尔加成接着是钯催化的环闭合来制备通式结构20(图11)和通式结构24(图12)的酰亚胺衍生物。通过先前描述的方法将该酰亚胺还原得到内酰胺异构体。实施例Ⅳ(1):2-(三丁基甲锡烷基)茚向含有在75ml Et3N中的2-溴代茚(1.64g,8.4mmol)的圆底烧瓶中加入乙酸钯(Ⅱ)(304mg,11.4mmol)，四(三苯基膦)钯(O)(775mg,0.7mmol)，和六丁基二锡(6.4ml,12.7mmol)。反应加热至回流并用TLC监测(硅胶，乙酸乙酯∶己烷；1∶5)。1小时后起始物反应完。将反应冷却到室温。用二氯甲烷稀释并通过硅藻土过滤。减压去除溶剂，化合物通过硅胶柱纯化(5％乙酸乙酯己烷)，得到4.7g2-(三丁基甲锡烷基)茚，为澄清的油状物(含有痕量六丁基二锡)。该化合物用于下一步反应。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ_0.9(m,15H),1.2(m,6H),1.6(m,6H),3.5(s,2H),7.10(s,1H),7.5-7.2(m,4H)。实施例Ⅳ(2):2,2’-联茚向装有回流冷凝器的100ml圆底烧瓶中加入1.2g(6.3mmol)2-溴代茚，3.4g(8.4mmol)2-三丁基甲锡烷基茚(实施例Ⅳ(1))，和70ml乙醇。向该混合物中加入442mg(0.63mmol)双(三苯基膦)钯(Ⅱ)氯化物。反应回流下搅拌16小时。将反应冷却到室温。用二乙醚(50ml)稀释然后通过氧化铝垫板过滤。减压浓缩溶剂，产物从甲苯中重结晶得到870mg(60％)2,2’-联茚。mp=238℃。(文献.mp=238℃；Chem.Ber.,1988,121,2195.)1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.73(s,4H),6.93(s,2H),7.30(m,8H)。MS(ES+)m/z=231(M/+1)。实施例(3):1a,3a,4,7-四氢茚基[2,3-c]茚基[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮向可密封的硼硅酸盐反应试管中加入98mg(0.4mmol)2,2’-联茚(实施例Ⅳ(2)),43mg(0.44mmol)马来酰亚胺，5mg BHT，和1ml二氯甲烷。将试管密封并将反应加热到130℃反应24小时。将反应冷却到室温，并减压浓缩溶剂。粗产物固体通过柱色谱纯化(硅胶，10-75％乙酸乙酯-己烷)，得到50mg(38％)白色固体。mp244-247℃。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.68(s,4H),3.80(m,2H),4.00(bs,2H),7.24(m,7H),7.53(d,J=7Hz,2H)。MS(ES+)m/z=328(M+1)。实施例Ⅳ(4):1H-茚基[2,3-c]-1H-茚基[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮(化合物Ⅰ-1)向实施例Ⅳ(3)(50mg,0.15mmol)的甲苯(4ml)混合物中一次加入固体2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯并醌(79mg,0.35mmol)。反应在氮气下在65-70℃加热4小时。溶液在冰浴中冷却，过滤收集固体物质。用冷甲醇洗涤粗产物沉淀，得到浅黄色固体。(28mg,63％)，mp244-247℃.1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.17(d,4Hz,2H),7.55(m,7H),4.15(s,4H)；MS(ES):m/z=346(M/+1)。实施例Ⅳ(5):1H-茚基[2,3-c]-1H-茚基[2,3-e]-3H-异吲哚-1-酮(化合物Ⅰ-2)将122mg(1.9mmol)锌屑悬浮于1ml水中并加入35mg(0.08mmol)HgCl2，接着加入4滴cHCl，制备锌汞齐。将该混合物搅拌10分钟，并倾析水层。用水洗涤汞齐，然后用乙醇重复洗涤。
将上述锌汞齐悬浮于5ml乙醇中并加入化合物Ⅰ-1(实施例Ⅳ(4))(10mg,0.03mmol)。加入几滴cHCl，然后将反应在回流下加热3小时。在加热的第一个小时内黄色消失。将反应冷却到室温，并减压浓缩溶剂。残余物溶解于10mlTHF-EtOAc(1∶1)，并用饱和的碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤后干燥(硫酸镁)。过滤去除干燥剂并减压浓缩溶剂，得到8mg(88％)内酰胺，为白色固体。mp256℃。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.20(d,8Hz,1H),7.50(m,6H),6.24(s,1H),4.83(s,2H),4.05(s,2H),3.95(s,2H)；MS(ES):m/z=310(M+1)。实施例Ⅳ(6):2,2’-二苯并噻吩向装有回流冷凝器的2口圆底烧瓶中加入3.3g(15.6mmol)2-溴代苯并噻吩，7.3g(17mmol)2-(三正丁基锡)苯并噻吩和40ml甲苯。向混合物中加入360mg(0.3mmol)四(三苯基膦)钯(O)和5mgBHT。反应回流下加热16小时。冷却到室温后真空去除溶剂，将反应产物溶解于DMF并通过硅藻土过滤。真空去除溶剂，用己烷研制固体得到3.58g(13.4mmol,85％产率)2,2’-二苯并噻吩，为银黑色固体。mp=260-262℃。1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ7.98(m,2H),7.62(s,1H),7.36(m,2H)；7.25(s,1H)。实施例Ⅳ(7):3,4-甲酰乙氧基苯并噻吩基[1,2-a]二苯并噻吩在一个可密封的玻璃试管中加入1.02g(3.8mmol)2,2’-二苯并噻吩，3.1ml(19mmol)乙炔二羧酸二乙酯，和5mgBHT。氮气下密封反应容器并在190℃加热。反应进行24小时。反应容器冷却后，用三氯甲烷将内含物转移到圆底烧瓶中，并真空去除溶剂。将固体溶解于二乙醚并过滤得到468mg(1.07mmol,28％)3,4-甲酰乙氧基苯并噻吩基[1,2-a]二苯并噻吩，为浅黄色固体，mp206-207℃。第二次结晶又得到280mg产物，总产率是45％。1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ8.27(d,7.4Hz,2H),8.05(d,7.9Hz,2H),7.65(m,4H)；4.57(q,7.1Hz,4H),1.38(t,7.1Hz,6H)。实施例Ⅳ(8)苯并噻吩基[4,5-a]苯并噻吩基[6,7-a]异苯并呋喃-1,3-二酮向圆底烧瓶中加入500mg(1.15mmol)3,4-甲酰乙氧基苯并噻吩基[1,2-a]二苯并噻吩和50mlDMF。向该混合物中加入124mg(2.5mmol)氰化钠和固体形式的476mg(2.5mmol)碘化锂三水合物。反应加热到150℃并用TLC监测。随时间的进行加入更多的氰化钠和碘化锂。在36小时的反应时间里加入了总量分别是4当量的氰化钠和碘化锂，此时反应物完全反应完。将反应混合物冷却到室温并倒入冷的(0℃)盐酸水溶液中。过滤混合物并用水洗涤。得到的固体在真空下干燥。
然后将上述粗产物固体放到圆底烧瓶中并加入50ml乙酸酐。然后将反应混合物加热回流。回流4小时后TLC表明反应完全(在1∶1乙酸乙酯/己烷中在Rf0.65处有新的斑点)。去除溶剂，通过快速色谱纯化粗产物油状物，得到亮橙黄色固体。该固体用二乙醚研磨，得到160mg(0.44mmol,40％产率)苯并噻吩基[4,5-a]苯并噻吩基[6,7-a]异苯并呋喃-1,3-二酮，为亮黄色固体。mp＞300℃。1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ9.54(dd,5.2Hz,2.5Hz,2H),8.34(dd,4.0Hz,3.3Hz,2H),7.73(m,4H)。实施例Ⅳ(9)苯并噻吩并[2,3-c]苯并噻吩并[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮(化合物Ⅰ-3)苯并噻吩基[4,5-a]苯并噻吩基[6,7-a]异苯并呋喃-1,3-二酮(75mg,0.2mmol)溶解于3mlDMF。向该混合物中加入4.4ml(20.8mmol)1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷，接着加入30μl(1mmol)甲醇。大约15分钟后悬浮液变澄清。1小时后TLC显示起始物几乎完全反应。使反应搅拌过夜，反应时间共18小时。去除溶剂得到65mg(0.18mmol,80％产率)苯并噻吩并[2,3-c]苯并噻吩并[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮，为黄色固体。mp＞300℃,1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ9.8(dd,5.0Hz,4.1Hz,2H),8.25(dd,4.9Hz,4.1Hz,2H),7.70(m,4H)。实施例Ⅳ(10)苯并噻吩并[2,3-c]苯并噻吩并[2,3-e]异吲哚-1-酮(化合物Ⅰ-4)向锌汞齐(3当量)的10ml乙醇悬浮液中加入68mg(0.18mmol)苯并噻吩并[2,3-c]苯并噻吩并[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮的10ml乙酸溶液。加入5ml浓盐酸后将反应加热回流。回流过夜后反应变得澄清并稍带有褐色。将反应冷却并倾析掉汞层。去除大多数溶剂后用乙酸乙酯稀释混合物，并用饱和的碳酸氢钠洗涤两次。有机层用硫酸镁干燥，过滤，并去除溶剂。粗反应混合物通过柱色谱纯化得到65mg(0.18mmol,100％产率)苯并噻吩并[2,3-c]苯并噻吩并[2,3-e]异吲哚-1-酮，为褐色固体。mp 225-226℃,1HNMR(300MHz,DMSO d6)δ10.17(dd,6.4Hz,2.7Hz,1H),8.22(s,1H),8.21(dd,4.1Hz,3.7Hz,2H),8.11(dd,6.5Hz,2.2Hz,1H),7.63(t,3.7Hz,2H),7.55(t,3.7Hz,2H),5.19(s,2H)。实施例Ⅳ(11):2-(2’-茚基)苯并噻吩向装有回流冷凝器的2口圆底烧瓶中加入2g(13.3mmol)2-溴代茚，5.1g(11.9mmol)2-(三正丁基锡)苯并噻吩和50ml甲苯。向混合物中加入1g(1.5mmol)双(三苯基膦)钯(Ⅱ)二氯化物和5mgBHT。反应回流下加热16小时。冷却后去除溶剂，将反应产物溶解于DMF/THF并通过硅藻土过滤。去除溶剂，用己烷研制固体，得到1.4g(5.6mmol,47％产率)2-(2’-茚基)苯并噻吩，为橙色固体。mp=260-265℃。1H NMR(DMSO d6)δ7.82(m,4H),7.61(s,1H),7.35(m,5H),3.97(s,2H)。实施例Ⅳ(12):3,4-甲酰乙氧基茚基[1,2-a]二苯并噻吩在一个可密封的玻璃试管中加入480mg(3.95mmol)2-(2’-茚基)苯并噻吩，3.2ml(19mmol)乙炔二羧酸二乙酯，和10mgBHT。氮气下密封反应容器并在190℃加热。反应进行24小时。反应容器冷却后，用三氯甲烷将内含物转移到圆底烧瓶中，并去除溶剂。粗产物通过二氧化硅柱，收集顶部级分。将固体溶解于二乙醚并过滤得到538mg(1.29mmol,23％)3,4-甲酰乙氧基茚基-[1,2-a]二苯并噻吩，为浅橙色固体，mp186℃。1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ8.15(d,7.4Hz,1H),7.95(d,7.4Hz,1H),7.71(m,2H),7.56(m,2H),7.41(m,2H),4.50(q,7.0Hz,4H),4.22(s,2H),1.33(t,7.0Hz,6H)。实施例Ⅳ(13)茚基[4,5-a]苯并噻吩基[6,7-a]异苯并呋喃-1,3-二酮向圆底烧瓶中加入250mg(0.6mmol)3,4-甲酰乙氧基茚基[1,2-a]二苯并噻吩和10ml吡啶。向该混合物中加入677mg(3.6mmol)碘化锂三水合物。反应加热到115℃并用TLC监测。随时间的进行加入更多的碘化锂。在36小时的反应时间里加入了总量是5当量的碘化锂，此时反应物完全反应完。将反应混合物冷却到室温并倒入冷的(0℃)盐酸水溶液中。过滤混合物并用水洗涤。得到的固体在真空下干燥。
然后将上述粗产物固体放到圆底烧瓶中并加入50ml乙酸酐。然后将反应混合物加热回流。回流4小时后TLC表明反应完全(在1∶1乙酸乙酯/己烷中在Rf0.6处有新的斑点)。去除溶剂，通过快速色谱纯化粗产物油状物，得到亮橙黄色固体。该固体用二乙醚研磨，得到160mg(0.44mmol,40％产率)茚基[4,5-a]苯并噻吩基[6,7-a]异苯并呋喃-1,3-二酮，为亮黄色固体。mp＞300℃。1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ_9.65(d,J=7.2Hz,1Hz),8.76(d,J=7.6Hz,1H),8.15(s,J=7.4Hz,1Hz),7.78-7.38(m,5H),4.97(s,2H)。实施例Ⅳ(14)茚基[2,3-c]苯并噻吩基[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮(化合物Ⅰ-5)茚基[4,5-a]苯并噻吩基[6,7-a]异苯并呋喃-1,3-二酮(120mg,0.35mmol)溶解于3mlDMF。向该混合物中加入7.4ml(35mmol)1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷，接着加入50μl(1mmol)甲醇。大约15分钟后悬浮液变澄清。1小时后TLC显示起始物几乎完全反应。使反应搅拌过夜，反应时间共18小时。去除溶剂得到35mg(0.18mmol,30％产率)茚基[2,3-c]苯并噻吩并[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮，为橙色固体1H NMR(300MHz,DMSO d6)δ_12.72(s,1H),9.84(d,J=8.3Hz,1H),8.14(d,J=6.4Hz,1H),8.07(d,J=7.5Hz,1H),7.82-7.28(m,5H),5.03(s,2H),MS(APcI)342(M+H)。实施例Ⅳ(15)茚基[2,3-c]苯并噻吩基[2,3-e]异吲哚-1和3-酮(化合物Ⅰ-6)向锌汞齐(3当量)的2ml乙醇悬浮液中加入10mg(0.3mmol)茚基[2,3-c]硫茚并[2,3-e]异吲哚-1,3-二酮的10ml乙酸溶液。加入1ml浓盐酸后将反应加热回流。回流3小时后反应变得澄清并稍带有褐色。将反应冷却并倾析掉汞层。去除大多数溶剂后用乙酸乙酯稀释混合物，并用饱和的碳酸氢钠洗涤两次。有机层用硫酸镁干燥，过滤，并去除溶剂。得到作为混合物茚基[2,3-c]硫茚并[2,3-e]异吲哚-1-酮的化合物，为褐色固体。MS(APcI)329(M+H)。
尽管本发明进行了相当详细的描述，但是这里所公开的本发明不局限于实际描述，而是权利要求书的全部范围和其等价物。
权利要求
1．化学结构是下式的化合物
其中B环和F环独立地选自下面的组(a)其中最多3个碳原子被氮原子置换的6-元芳香碳环；(b)5-元芳香碳环；和(c)5-元芳香碳环，其中(1)一个碳原子被氧原子，氮原子，或硫原子置换；或者(2)两个碳原子被一个氮原子和一个硫原子，或一个氮原子和一个氧原子置换；R1选自H,1-4碳原子烷基；芳基；芳基烷基；杂芳基；杂芳基烷基；COR9，其中R9选自1-4碳原子烷基，芳基和杂芳基；-OR10，其中R10选自H和1-4碳原子烷基；-CONH2,-NR7R8,-(CH2)nNR7R8，和-O-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4，和(a)R7和R8独立地选自H和1-4碳原子烷基；或(b)R7和R8一起形成式-(CH2)2-X1-(CH2)2-连接基团，其中X1选自-O-,-S-，和-CH2-；A1和A2双双选自H,H；H,-OR11，其中R11是H,1-4碳原子烷基，6-10碳原子芳基，或杂芳基；H,-SR11；H,-N(R11)2；=O；=S；和=NR11，其中A1和A2一起代表双键键合的原子；B1和B2双双选自H,H；H,-OR11；H,-SR11；H,-N(R11)2；=O；=S；和=NR11，其中B1和B2一起代表双键键合的原子；前提是A1和A2，及B1和B2对中的至少一个是=O；在每个位置上的X独立地选自下组(a)未取代的1-3碳原子亚烷基；(b)R2取代的1-3碳原子亚烷基，其中R2选自下组(1)OR10；-SR10；R15，其中R15是1-4碳原子烷基；苯基；萘基；7-14碳原子芳基烷基；H；-SO2R9；-CO2R9；-COR9；1-8碳原子烷基，链烯基或炔烃基，其中(ⅰ)1-8碳原子每一烷基，链烯基或炔基是未取代的；或(ⅱ)1-8碳原子的每一烷基，链烯基或炔基是被一个取代基取代的，取代基选自1-3个6-10碳原子芳基；杂芳基；F；Cl；Br；I；-CN；-NO2；OH；-OR9；-O-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4；-OCOR9；-OCONHR9；O-四氢吡喃基；NH2；-NR7R8；-NR10COR9；-R10CO2R9；-NR10CONR7R8；-NHC(=NH)NH2；-NR10SO2R9；-S(O)yR11，其中y是1或2；-SR11；-CO2R9；-CONR7R8；-CHO；COR9；-CH2OR7；-CH=NNR11R12，其中R12选自H,1-4碳原子烷基；6-10碳原子芳基，和杂芳基；-CH=NOR11；-CH=NR9；-CH=NNHCH(N=NH)NH2；-SO2NR12R13，其中R13选自H,1-4碳原子烷基；6-10碳原子芳基，和杂芳基；或者R12和R13一起形成一个连接基团；-PO(OR11)2,-OR14，其中R14是羧基中的羟基去除后的氨基酸残基；或者(2)5-7碳原子单糖，其中单糖的各羟基独立地是未取代的或者被H，1-4碳原子烷基，2-5碳原子烷基羰基氧基或1-4碳原子烷氧基置换；和(c)选自下组的官能团-CH=CH；-CHOH-CHOH-；-O-；-S-；-S(=O)-；-S(S=O)2-；-C(R10)2-；-C=C(R2)2；-C(=O)-；-C(=NOR11)-；-C(OR11)(R11)-；-C(=O)CH(R15)-；-CH(R15)C(=O)-；-C(=NOR11)CH(R15)-；-CH(R15)C(=NOR11)-；CONR15；NR15CO；-CH2Z-，其中Z是-CR11；-Z-CH2-；-CH2ZCH2-；-O-；-S-；-C(=O)OR11；-C(=NOR11)；和-NR11；R3,R4,R5和R6各自独立地选自H；芳基；杂芳基；F；Cl；Br；I；-CN；CF3；-NO2；OH；-OR9；-O(CH2)nNR7R8；-OCOR9；-OCONHR9；NH2；-CH2OH；-CH2OR14；-NR7R8；-NR10COR9；-NR10CONR7R8；-SR11；-S(O)yR11，其中y是1或2；-CO2R9；-COR9；-CONR7R8；-CHO；-CH=NOR11；-CH=NR9；-CH=NNR11R12；-(CH2)nSR9，其中n是1-4；-(CH2)nS(O)yR9；-CH2SR15，其中R15是1-4碳原子烷基；-CH2S(O)YR14；-(CH2)nNR7R8；-(CH2)nNHR14；1-8碳原子烷基，链烯基，炔烃基，其中(a)1-8碳原子每一烷基，链烯基或炔烃基是未取代的；或(b)1-8碳原子每一烷基，链烯基或炔烃基被下面的基团取代1-3个6-10碳原子芳基；杂芳基；F；Cl；Br；I；-CN；-NO2；OH；-OR9；-O(CH2)nNR7R8；-OCOR9；-OCONHR9；O-四氢吡喃基；NH2；-NR7R8；-NR10COR9；-NR10CO2R9；-NR10CONR7R8；-NHC(=NH)NH2；-NR10SO2R9；-S(O)yR11，其中y是1或2；-SR11；-CO2R9；-CONR7R8；-CHO；COR9；-CH2OR7；-CH=NNR11R12；-CH=NOR11；-CH=NR9；-CH=NNHCH(N=NH)NH2；-SO2NR12R13；-PO(OR11)2；-OR14；或5-7碳原子单糖，其中单糖的各羟基独立地是未取代的或者被H,1-4碳原子烷基，2-5碳原子烷基羰基氧基或1-4碳原子烷氧基置换。
2．权利要求1的化合物，其中化学结构是
3．权利要求2的化合物，其中A1和A2双双选自H,H；H,-OH，和=O；B1和B2双双选自H,H；H,-OH，和=O；前提是A1和A2，或B1和B2是=O。
4．权利要求2的化合物，其中R1是H。
5．权利要求2的化合物，其中R1是COR9，且R9选自苯基和萘基。
6．权利要求2的化合物，其中X在任一位置，或两个位置，是1-3碳原子未取代的亚烷基。
7．权利要求2的化合物，其中X在任一位置，或两个位置，是选自-O-，和-S-。
8．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，且R2是-OR10。
9．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，且R2是苄基。
10．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，且R2选自1-4碳原子烷基，1-4碳原子链烯基，和1-4碳原子炔烃基。
11．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，且R2选自取代的1-8碳原子烷基，取代的1-8碳原子链烯基，和取代的1-8碳原子炔烃基，且R2具有选自苯基和萘基的取代基。
12．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，R2是-S(O)yR11,y是1或2，且R11是苯基或萘基。
13．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，R2是-CH=NNR11R12或-SO2NR12R13，且R12或R13选自苯基和萘基。
14．权利要求2的化合物，其中X具有R2取代基，且R12或R13一起代表连接基团。
15．权利要求14的化合物，其中所述连接基团是-(CH2)2-X1-(CH2)2-，其中X1选自-O-；-S-；和-CH2-。
16．权利要求2的化合物，其中R3,R4,R5，和R6是H。
17．权利要求2的化合物，其中R3,R4,R5，和R6中至少一个选自苯基和萘基，前提是R3或R4是H，和R5或R6是H。
18．权利要求2的化合物，其中R3,R4,R5，和R6中至少一个选自1-4碳原子烷基，1-4碳原子链烯基，和1-4碳原子炔烃基，前提是R3或R4是H，和R5或R6是H。
全文摘要
本发明公开了具有生物活性的不含吲哚的化合物,称之为稠合异吲哚酮,其用通式(Ⅰ)代表。该稠合异吲哚酮可以通过完全的化学合成获得。本发明也公开了制备和使用该稠合异吲哚酮的方法。
文档编号C07D209/70GK1224417SQ96199806
公开日1999年7月28日 申请日期1996年12月11日 优先权日1995年12月11日
发明者罗伯特·L·赫德金斯, 尼尔·W·约翰逊 申请人:塞弗朗公司