一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用，所述植物表达载体包括插入原始载体的目的基因和启动子，所述的目的基因包括顺次相连的颗粒结合型淀粉合成酶的转运肽基因片段和马铃薯葡聚糖水合二激酶基因，所述的启动子为大麦胚乳特异性启动子HorD。本申请将马铃薯葡聚糖水合二激酶基因转入水稻中，马铃薯葡聚糖水合二激酶基因的表达能够使水稻的淀粉发生磷酸化，从而对淀粉实现改性。颗粒结合型淀粉合成酶转运肽引导马铃薯葡聚糖水合二激酶到达淀粉体，对淀粉进行磷酸化改性。本发明将大麦胚乳特异性启动子HorD能够促进马铃薯葡聚糖水合二激酶基因在水稻胚乳中的表达，大幅度提高水稻淀粉中的磷含量。
【专利说明】一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于淀粉改性【技术领域】，尤其涉及一种植物表达载体及在制备磷酸化改性 水稻淀粉中的应用。
【背景技术】
[0002] 淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉是由α_1，4糖苷键连接而成的 线形多聚糖，约占淀粉组成的30%。支链淀粉是由α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键连接而 成的具有高度分支的多聚糖，约占70%。
[0003] 作为一种天然高分子化合物，淀粉广泛应用于许多工业部门，但由于天然淀粉物 理化学性质具有一定的局限性，已不能适应近代食品、纺织、造纸和其他工业的需要，例如 食品工业中希望能有粘度稳定，冻融稳定性好的食品添加剂，造纸业希望能有新型的施胶 齐U，以提高纸张的湿强度、耐折度、并能增加纸张产量和降低白水的浓度，纺织业希望能采 用在粘度，成膜性，浆膜的机械性等方面有着良好性能的浆料等。为了满足这些性能方面的 新要求，就必须改变淀粉的性状，一般可以利用热、酸、碱、氧化剂、酶制剂等改变天然淀粉 的物化性质，主要是通过淀粉本身的结构产生变化，从而扩大淀粉的应用范围。
[0004] 淀粉磷酸化是淀粉改性的一种方法，磷酸化改性可以降低淀粉糊化温度，提高粘 度和透明性。经磷酸化改性的淀粉具有良好的分散乳化性，抗老化能力提高，且具有一定与 阳离子结合的能力。传统淀粉磷酸改性工艺都是基于对天然植物淀粉进行的化学改性，即 在碱性条件下与磷酸盐在120?125°C下发生酯化反应，产生淀粉磷酸单酯的过程。由于酯 化反应是一种可逆反应，且对温度的要求非常严格，不论湿法改性或干法改性，或者是用何 种化学药品作为反应底物，均造成了很大的资源与能源浪费，产生的废弃物和副产物对环 境造成了巨大的污染。
[0005] 在植物体内淀粉磷酸化是由葡聚糖磷酸二激酶催化的。在马铃薯和拟南芥中已 鉴定出这种酶的两种同系物，分别为葡聚糖水合二激酶（glucan-water dikinase，GWD, EC 2· 7· 9· 4)和憐酸葡聚糖水二激酶（phosphoglucan-water dikinase，EC 2· 7· 9· 5)。前 者催化转移ATP的β-磷酸至葡萄糖基的C-3或C-6位置，将γ-磷酸转移至水分子，释 放正磷酸，而后者催化转移磷酸至磷酸多糖（已经过葡聚糖磷酸二激酶磷酸化）和水。可 逆性淀粉磷酸化发生在植物叶片临时淀粉降解过程中，也可发生某些植物块根、块茎和果 实中。淀粉磷酸化现象在植物界普遍存在，但是不同物种间淀粉磷酸含量有显著差别，马 铃薯块茎淀粉磷酸含量较高（7?33nmol G6P/mg)，而谷物籽粒淀粉的磷酸化程度极低， 几乎不可测。编码葡聚糖水合二激酶蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，在番茄（Genbank: ΝΡ_001 2344〇5·1)、马铃薯（Genbank:AFH88388.l)、小麦（Genbank:ADG 27838.l)、水 稻（Genbank:ABA978l6· 2)、葡萄（Genbank:XP_0〇22652ll.l)和拟南芥（Genbank: AAU93516. 1)等都有发现。
[0006] 近年来，利用生物技术对淀粉进行生物改性生产改性淀粉已经成为热点。由于产 生改性淀粉的过程无污染、不需要进一步的加工工艺，已经引起了越来越多国内外淀粉研 究工作者们的注意。淀粉磷酸化作为植物体淀粉代谢过程中唯一发生的共价修饰，对催化 淀粉磷酸化的酶及相关基因的研究具有重要意义和应用价值。但是国内对葡聚糖水合二激 酶的研究相对较少，虽然有报道将葡聚糖水合二激酶转入植物中来改性淀粉，但是改性淀 粉的磷含量比较低（即磷酸化水平低），为了进一步提高淀粉的磷含量，往往需要同时转入 多种酶基因来达到这一目的，如中国专利申请200780028601. 1在植物中同时转入淀粉合 酶II基因和葡聚糖水合二激酶基因。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种植物表达载体，转入水稻植株后，可以显著提高水稻中磷酸化 淀粉的含量。
[0008] -种植物表达载体，包括插入原始载体的目的基因和启动子，所述的目的基因包 括顺次相连的颗粒结合型淀粉合成酶的转运肽基因片段和马铃薯葡聚糖水合二激酶基因， 所述的启动子为大麦胚乳特异性启动子HorD。
[0009] 所述的马铃薯葡聚糖水合二激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 所述的大麦胚乳特异性启动子HorD的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0011] 所述颗粒结合型淀粉合成酶的转运肽基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
[0012] 所述的原始载体可以为一般的用于植物转化的载体，如可以为pUCE。
[0013] 本发明还提供了所述植物表达载体在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用。
[0014] 本发明还提供一种磷酸化改性水稻淀粉的制备方法，包括：
[0015] (1)将所述的植物表达载体转入水稻植株，筛选获得转基因植株；
[0016] (2)对所述的转基因植株进行逐代纯化，获得稳定表达马铃薯葡聚糖水合二激酶 的水稻株系；
[0017] (3)从所述的水稻株系中提取获得改性水稻淀粉。
[0018] 步骤（1)中，转化的水稻品种可以为中花II、绍粳08-31等，转化糯性水稻绍粳 08-31后，获得的磷酸化改性水稻淀粉具有更高的粘度。
[0019] 提取磷酸化改性水稻淀粉时，可以从水稻的籽粒（种子）中提取。
[0020] 本发明还提供了所述制备方法获得的磷酸化改性水稻淀粉。
[0021] 本发明还提供了所述的磷酸化改性水稻淀粉在造纸、制备纺织浆料中的应用。如， 所述的磷酸化改性水稻淀粉在造纸中可作为造纸湿部添加剂，在纺织业中可用于配制上桨 的浆料，均可达到相关的标准，可替代化学改性的淀粉磷酸酯。
[0022] 本发明还提供了一种培育富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻的方法，包括：
[0023] 将所述的植物表达载体转入水稻植株，筛选获得转基因植株；对所述的转基因植 株进行逐代纯化，获得稳定表达马铃薯葡聚糖水合二激酶的水稻株系。
[0024] 本发明还提供了一种富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻在水稻遗传育种中的应 用，所述的富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻通过上述的方法获得。所述的转基因水稻可 以与其他淀粉性状优良的水稻品种进行杂交、回交后，可获得性质优良的水稻品种。如，转 化的水稻为中花II时，获得转基因水稻与绍粳08-31进行杂交、回交，育成的糯稻品系的淀 粉较转基因中花II的粘度提高。
[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0026] (1)本申请将马铃薯葡聚糖水合二激酶基因转入水稻中，马铃薯葡聚糖水合二激 酶基因的表达能够使水稻的淀粉发生磷酸化，从而对淀粉实现改性。本申请中，启动马铃薯 葡聚糖水合二激酶的启动子为大麦胚乳特异性启动子HorD。大麦胚乳特异性启动子HorD 是大麦醇溶蛋白D启动子HorD，大麦的醇溶蛋白具有很高的多态性，主要的作用是储存蛋 白质，在大麦种子中合成。其启动子HorD为胚乳特异型启动子，可在大麦胚乳中特异性表 达。
[0027] 颗粒结合型淀粉合成酶（GBSSI)是能与发育中的淀粉颗粒紧密结合的有活力的 蛋白，本发明选取大麦颗粒结合型淀粉合成酶中编码转运肽的基因片段，将其与马铃薯葡 聚糖水合二激酶基因的相连，以使转运肽引导马铃薯葡聚糖水合二激酶到达淀粉体，对淀 粉进行磷酸化改性。
[0028] 本发明将大麦胚乳特异性启动子HorD和颗粒结合型淀粉合成酶的转运肽基因片 段组在一起，能够促进马铃薯葡聚糖水合二激酶基因在水稻胚乳中的表达，大幅度提高水 稻淀粉中的磷含量，磷含量较野生型的水稻籽粒淀粉可提高10倍。
[0029] (2)葡聚糖水合二激酶基因（GWD)在马铃薯叶片、茎与块茎中表达，而在像水稻等 谷物作物中，也只在茎叶中有所表达，在籽粒中并不表达。利用一般组成型启动子35S构建 的载体的转基因水稻葡聚糖水合二激酶基因在水稻的叶片和茎中表达。采用本发明的启动 子后，葡聚糖水合二激酶基因可在水稻的籽粒中大量表达。另外，尽管大麦胚乳特异性启动 子HorD为胚乳特异性启动子，但是本发明发现，大麦胚乳特异性启动子HorD在水稻中的并 不具有高特异性，葡聚糖水合二激酶基因不仅在水稻籽粒中表达，同时也在水稻的叶片、茎 中均可大量表达。
[0030] (3)本发明磷酸化改性的水稻淀粉颗粒结构发生变化，磷含量增高，较野生型水稻 植株提高了 10倍，从而淀粉的热力学性能发生改变，糊化温度降低。本发明通过生物改性 的水稻淀粉可部分或完全取代化学改性的淀粉磷酸酯，从而可避免传统的化学方法对淀粉 的磷酸化改性存在着严重的资源和能源浪费及环境污染问题。
[0031] (4)本发明提供了培育富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻的方法，通过该方法获 得富含磷酸化改性水稻淀粉的水稻，且该水稻还可应用于遗传育种中。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图 1 为 pUCED_H。 rD ：GBSS-StGWD ：N0S 载体构建示意图。
[0033] 图2为实施例1中转基因水稻植株鉴定结果图。
[0034] 图3为实施例1中转基因水稻植株组织（采用本申请的启动子）中马铃薯葡聚糖 水合二激酶基因的表达情况。
[0035] 图4为实施例1野生型及改性水稻淀粉的电镜图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0037] 实施例1改性水稻淀粉的生产
[0038] 1、构建植物表达载体
[0039] (1)马铃薯葡聚糖水合二激酶基因的克隆
[0040] ①以马铃薯葡聚糖水合二激酶基因（StGWD)的序列设计特异引物，引物的碱基序 列如下：
[0041] StGWD-F :5, -GGTCTTAAUTGCTGTACTTACCACTGATACCTC-3,；
[0042] StGWD-R : 5 ' -GGCATTAAUTCACATCTGTGGTCTTGTCTGAAC-3 '。
[0043] ②以马铃薯转录组RNA为模板，利用StGWD-F/StGWD-R引物进行RT-PCR扩增，回 收目的条带连接到PUCE后，转入到大肠杆菌DH5 α后进行测序，通过对测序结果的比对， 得知StGWD基因的全长为4167bp，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，由此构建得到载体 pUCEstGWD。
[0044] (2)启动子的克隆
[0045] ①以大麦（金诺）基因组DNA为模板，以HorD-F/HorD-R为引物，用高保真酶prime star NS DNA polymerase PCR扩增大麦胚乳特异启动子HorD，大麦胚乳特异启动子HorD 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0046] HorD-F ：5/ ~CCGGAATTCCATACGATTTAGGTGACA~3'；
[0047] EcoR I
[0048] HorD-R ：5/ ~CCCAAGCTTTTCTAGACTCGGTGGACT~3'。
[0049] Hind III
[0050] ②针对大麦颗粒结合淀粉合成酶GBSSI基因中编码转运肽的功能域设计引物，弓丨 物的碱基序列如下：
[0051] GBSS-F ：5/ -CCCAAGCTTATGGCGGCTCTGGTCACGTC-3 ;；
[0052] Hind III
[0053] GBSS-R ：5/ -CTAGCTAGCGCTACAACAAGCGGCTATCTCCT-3 ;。
[0054] Nhe I
[0055] 以大麦（金诺）基因组DNA为模板，以GBSS-F/GBSS-R为引物，用高保真酶prime star NS DNA polymerase进行PCR扩增，扩增得到的大麦颗粒结合淀粉合成酶基因编码转 运肽的功能域片段如SEQ ID N0. 2所示。
[0056] ⑶连接载体
[0057] 将扩增的HorD和GBSSI片段与pGM-T载体连接，获得的重组质粒载体pGM-T-HorD 与 pGM-T-GBSSI。先将 pGM-T-HorD 用 EcoR I 和 Hindlll 双酶切，pGM-T-GBSSI 用 Hind III 和Nhe I双酶切后，回收目的片段。用T4 DNA连接酶将回收的HorD和GBSSI片段与表达 载体pUCEsteTO连接。载体构建示意图如图1所示。
[0058] 2、转化水稻
[0059] (1)取10 μ LpUCED_HOTD :GBSS_st(；TO :NQS质粒与EHA105根瘤农杆菌感受态细胞均匀混合， 冰上放置30min ;将装有感受态细胞的离心管浸入液氮5min，37°C水浴5min，重复一次；向 离心管中加入800 μ LYEB培养基，28°C 180r/min培养lh后，涂布到含有卡那霉素和利福平 的YEP培养基上培养2天，菌落PCR鉴定。
[0060] (2)采用农杆菌介导的方法转化水稻（中花II)愈伤组织，获得转化水稻植株。具 体方法可参照常规文献（1993, Chan et al.，Plant Mol. Biol. 22,491-506 ;Hiei et al.， 1994， Plant J.6,271_282;Deng et al.，1990， Science in China 33,28_34;Wilmink et al. ,1992, Plant Cell Reports 11,76-80 ；May et al. ,1995, Bio/Technology 13, 486-492 ；Conner and Domisse,1992, Int.J. Plant Sci. 153,550-555 ；Ritchie et al., 1993, Transgenic Res. 2,252-265)记载的方法。
[0061] (3)转基因水稻的筛选、鉴定
[0062] 采用CTAB法制备上述转化水稻植株的叶片DNA。具体步骤如下：
[0063] 选取新鲜水稻叶片3g，用液氮研磨；加入1ml 65°C预热的2XCTAB，将混合液置于 2ml离心管中，65°C水浴加热40min，每隔8?10min振荡一次；冷却至室温，加入氯仿、异戊 醇（24 : 1)混合液lml，上下颠倒，静止10分钟；12000rpm离心10min后吸上清于干净的 1. 5ml离心管中；加入等体积预冷的异丙醇，-20°C沉淀1?2小时，沉淀DNA ;12000rpm离 心10min，弃上清，加入75%乙醇漂洗lmin ;12000rpm离心5min，弃上清，将离心管倒置于 吸水纸上，充分干燥；加入150 μ 1无菌水溶解备用。
[0064] 以提取的基因组DNA为模板，以潮霉素（ΗΡΤ)标记引物进行PCR扩增，筛选阳性植 株。
[0065] 潮霉素引物序列如下：
[0066] HPT-F :5' -ATGTTGGCGACCTCGTATTT-3' ；
[0067] HPT-R : 5 ' -CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3 '。
[0068] PCR扩增体系（反应体系可按需求相应放大）如表1。
[0069] 表 1
[0070]
【权利要求】
1. 一种植物表达载体，包括插入原始载体的目的基因和启动子，其特征在于，所述的目 的基因包括顺次相连的颗粒结合型淀粉合成酶的转运肽基因片段和马铃薯葡聚糖水合二 激酶基因，所述的启动子为大麦胚乳特异性启动子HorD。
2. 如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述马铃薯葡聚糖水合二激酶基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1示。
3. 如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 示。
4. 如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述颗粒结合型淀粉合成酶的转 运肽基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
5. 如权利要求1?4任一所述植物表达载体在制备磷酸化改性水稻淀粉中的中应用。
6. -种磷酸化改性水稻淀粉的制备方法，包括： (1) 将所述的植物表达载体转入水稻植株，筛选获得转基因植株； (2) 对所述的转基因植株进行逐代纯化，获得稳定表达马铃薯葡聚糖水合二激酶的水 稻株系； (3) 从所述的水稻株系中提取获得改性水稻淀粉。
7. -种如权利要求6所述的制备方法获得的的磷酸化改性水稻淀粉。
8. 如权利要求7所述的改性水稻淀粉在制备纺织浆料或在造纸中的应用。
9. 一种培育富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻的方法，包括： 将权利要求1?4任一所述的植物表达载体转入水稻植株，筛选获得转基因植株；对所 述的转基因植株进行逐代纯化，获得稳定表达马铃薯葡聚糖水合二激酶的水稻株系。
10. -种富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻在水稻遗传育种中的应用，其特征在于，所 述的富含磷酸化改性淀粉的转基因水稻通过如权利要求9所述的方法获得。
【文档编号】C08B30/00GK104232681SQ201410506096
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】包劲松, 孙潇 申请人:浙江大学