嵌合穿膜抗菌肽B6N2及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种嵌合穿膜抗菌肽b6n2及其应用。

背景技术：

传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，促使人们去寻找新型的抗微生物制剂。天然抗菌肽多为13-45个氨基酸残基组成的短肽，具有广谱抗菌、调节免疫、抑制肿瘤等多种生物学功能、作用机制独特，是目前抗生素替代品研究的热点之一。但是由于其过大的分子量和本身的亲水性质，在一定程度上限制了它们在体内的应用。另外，畜牧业中，由葡萄球菌、沙门氏菌引发的疾病如乳房炎、关节炎、伤寒、肠热病、胃肠炎和败血症等发病率高，持续时间长，易传播，治愈后易反复，给养殖业造成巨大经济损失。其中部分原因即是这些细菌属于兼性胞内寄生菌，可侵染进入宿主细胞胞内，从而逃逸宿主免疫系统及外用药物的杀伤作用，一方面，当饲养环境突变或在其他不良应激导致的动物机体免疫力下降时，即可导致再次感染；另一方面，病原菌感染免疫细胞后亦可利用免疫细胞的转移特性加速菌体移位，加重病情；另外，即使持续性感染动物不表现病状，其携菌排泄物亦可导致大面积畜禽传染病的发生。由于受到生物膜系统的阻碍，抗菌药物尤其是多肽药物分子很难进入到靶向器官和组织的细胞中发挥作用。针对以上问题，人们研发了多种应对方式，如微管注射、电穿孔以及穿孔蛋白法。上述方式，虽有优势，但也存在不足，例如对细胞刺激大，导入率偏低以及靶向性不强等。

近年来，具有穿透细胞膜能力的小分子多肽如mpg、pep-1、tat、penetration、blfcin6等逐渐成为药物研制中利用的焦点。它们可以穿透细胞膜，故称为穿膜肽(cell-permeablepeptides,cpp)，cpp通常为含有5-30个氨基酸的小肽，由天然、非天然或嵌合蛋白衍生而来，可分为两大类：一类通过化学键连接导入物，另一类可与导入物形成稳定的非共价复合物发挥作用。cpp具有低毒性、对导入物类型无特殊限制等特点，受到人们的广泛关注。它可将寡核苷酸、质粒dna、小肽、蛋白、纳米颗粒、病毒等物质导入细胞内发挥作用(heitzf等，twentyyearsofcell‐penetratingpeptides:frommolecularmechanismstotherapeutics.britishjournalofpharmacology,2009,157(2):195-206)。在疾病靶向治疗、增强药物吸收等领域具有良好的应用前景。

由高活性抗菌肽n2是海蚯蚓抗菌肽nz17074的衍生肽，对g-细菌，尤其是大肠杆菌和沙门氏菌具有良好的杀菌效果。抗菌肽n2可穿透大肠杆菌外膜，利用嵌插方式与dna结合，并影响dna复制，但n2处理后的沙门氏菌细胞膜完整，处理2h后细胞膜穿透率仅为5.84％(antibacterialanddetoxifyingactivityofnz17074analogueswithmulti-layersofselectiveantimicrobialactionsagainstescherichiacoliandsalmonellaenteritidis.scientificreports,2017,7(1):3392.)，这很大程度上限制了其对胞内逃逸掉的沙门氏菌的消除作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供新型的嵌合穿膜抗菌肽b6n2及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的新型嵌合穿膜抗菌肽b6n2，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明所用cpp为blfcin6(b6)，嵌合肽由两部分组成：穿膜肽blfcin6和抗菌肽n2(seqidno:2)，可表示为blfcin6-n2，简称b6n2。

可以采用多肽固相合成法或液相多肽合成法合成抗菌肽b6n2。

本发明还提供上述抗菌肽b6n2中的至少一个氨基酸被其对应的d型氨基酸所取代而形成的抗菌肽。

本发明提供的抗菌肽b6n2可以是药学上可接受的盐形式。

带有修饰基团的抗菌肽也属于本发明的保护范围。可在所述抗菌肽的c端或n端共价或非共价连接修饰基团，所述修饰基团包括但不限于乙酰基、酰胺基、甲基、醛基、酯基、n-烷基。

本发明还提供表达盒、表达载体、克隆载体、转基因细胞系或工程菌，其包括包含编码所述抗菌肽b6n2基因序列的核酸。

本发明还提供所述抗菌肽b6n2在制备广谱抗菌药物或组合物中的应用。

本发明还提供由所述抗菌肽b6n2制备的广谱抗菌药物或组合物。

所述细菌为革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌、沙门氏菌等。

本发明的抗菌肽b6n2可以穿过细胞膜杀死内部的鼠伤寒沙门氏菌。

本发明还提供所述抗菌肽b6n2在制备促进皮肤伤口愈合药物、抑制多药耐药菌药物中的应用。

本发明的药物或组合物的剂型可以是丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释制剂、注射剂、微粒制剂、口服肠溶剂或控释制剂等。

本发明还提供所述抗菌肽b6n2在食品添加剂、化妆品、饲料添加剂领域中的应用。

本发明进一步提供含有所述抗菌肽b6n2的食品添加剂、化妆品、饲料添加剂。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明是在高活性抗菌肽n2的基础上连接具有6个氨基酸的细胞穿膜肽blfcin6，成功偶联后的产物b6n2对鼠伤寒沙门氏菌atcc14028具有显著的与其母体肽n2相似的抑菌活性(mic2μm)mic2μm。另外，通过量效曲线比较b6n2和母体肽n2，在亚抑菌浓度下仍然呈现较高的疗效。胞内杀菌试验证明，50μm的b6n2相对100μm的n2杀菌率提高了47.2％。共聚焦显微镜显示b6n2入胞的比例远远高于n2。mtt实验显示b6n2仅具有较小毒性。

本发明提供的嵌合穿膜抗菌肽b6n2结构简单、低毒安全、成本较低、合成相对容易，是一种可高效穿膜并杀死胞内沙门氏菌的新型嵌合穿膜杀菌肽。本发明的抗菌肽b6n2可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中合成后的肽b6n2用maldi-tofms分析图。

图2为本发明实施例2中b6n2对raw264.7细胞(小鼠腹腔巨噬细胞细胞系)毒性实验结果。ciprofloxacin:环丙沙星。

图3为本发明实施例4中b6n2对胞外沙门氏菌的量效曲线实验结果。

图4为本发明实施例5中b6n2对胞内沙门氏菌的杀菌试验结果。cip:环丙沙星。

图5为本发明实施例6中b6n2进行fitc荧光标记后，与raw264.7细胞孵育，荧光共聚焦显微实验成像图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：

mh培养基：酪蛋白水解物17.5g/l，牛肉浸粉5g/l，淀粉1.5g/l。

mha培养基：在mh培养基中加入2％的琼脂粉。

以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为maldi-tofms法。

以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为高效液相hplc法。

以下实施例中涉及的菌种见表1，这些菌种是公众可以得到的，

无需进行保藏。

表1供试菌种

实施例1嵌合穿膜抗菌肽的制备

在高活性抗菌肽n2(seqidno:2)的基础上连接具有6个氨基酸的细胞穿膜肽blfcin6，设计出新型嵌合穿膜抗菌肽b6n2，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

可采用fmoc固相合成法制备抗菌肽b6n2。

1、合成顺序：从序列c端到n端，步骤如下：

1)称取n当量树脂放入反应器，加入dcm溶胀半小时，然后抽掉dcm，加入序列中的第一个氨基酸(fmoc-asn(trt)-oh)2n当量，加2n当量的diea，适量的dmf，dcm(适量指能使树脂充分膨胀起来)，diea(二异丙基乙胺)，dmf(n,n-二甲基甲酰胺)，dcm，氮气鼓吹60min，然后加入5n当量甲醇，反应半小时，抽掉滤液，用dcm、甲醇洗净。

2)向反应器中加入序列中第二个氨基酸(fmoc-cys(trt)-0h)2n当量，2n当量hbtu(1-羟基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸盐)，diea，氮气鼓吹60min，抽掉滤液用茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端，最后洗净，加入适量的脱帽液去除fmoc保护基，洗净，茚三酮检测。

3)依步骤2)的方式依次加入序列中不同氨基酸进行反应直至最后一个氨基酸fmoc-tyr(tbu)-oh。

4)将树脂用真空抽干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，向烧瓶中加入切割液(切割液加入量为10ml/克)，切割液组成为：tfa95％，二硫醇2％，三异丙基硅烷2％，水1％。震荡反应后滤掉树脂。

5)得到的滤液中加入大量乙醚离心沉淀得到粗产物。

6)粗肽在碱性条件下空气氧化24小时后送ms检测，氧化完全得到一步氧化粗品。

7)一步氧化完成后进行二步氧化(碘氧化)，得到二步氧化粗品后进行纯化。

2、多肽纯化：

用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度，测试中所用纯度均为>90％。

3、多肽冻干

纯化好的液体放入冻干机中冷冻干燥，冻干成白色粉末。

分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)，结果见图1。

抗菌肽b6n227个氨基酸组成，分子量为3539.2da，等电点为11.26。

实施例2嵌合穿膜抗菌肽的细胞毒性实验

1、收集对数期raw264.7细胞(小鼠腹腔巨噬细胞细胞系)，调整细胞悬液浓度，每孔加入7×10³个细胞，5％co2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)。

2、配制不同浓度的抗菌肽b6n2溶液(用0.01m的磷酸盐缓冲液溶解)，同时设三个阴性对照孔，37℃，5％co2培养1-5h。

3、每孔加入20ulmtt溶液，继续培养4h后终止培养，小心吸去孔内培养液。

4、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。

5、同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)。

结果如图2所示，从图2可以看出，连接cpp后b6n2的毒性相对母体肽n2来说对raw264.7细胞的毒性稍微增强，在浓度为256ug/ml时细胞存活率为87％。

实施例3抗沙门氏菌活性检测

抗菌肽b6n2对沙门氏菌的最小抑菌浓度(mic)参照tian等(tian等，expressionofantimicrobialpeptidelhmultimersinescherichiacolic43(de3).appliedmicrobiologyandbiotechnology,2009,83(1):143-149)建立的微量肉汤稀释法，根据具体情况略有改动，具体操作如下：

1)挑取供试菌株单克隆至mh培养基，37℃，250rpm，振荡过夜培养；

2)将抗菌药物按2倍梯度系列稀释至1.5ml无菌离心管中，浓度分别是终浓度的10倍；

3)以1％的接种量分别将供试菌株转接至mh液体培养基中37℃，250rpm振荡培养至0.5个麦氏标准比浊；

4)将供试菌培养液稀释1000倍(最终菌体浓度约为10⁵cfu/ml)，转移至无菌细胞培养板中，每孔含稀释后菌液90μl；

5)加入稀释后的药物10μl，每个浓度3个平行样，并预留无药物阴性对照孔。加无菌培养板板盖，封口膜封闭后37℃静止培养至阴性对照空出现肉眼可见的明显浑浊菌液。将细胞培养板取出，观测结果，mic值是能够明显抑制受试菌株生长的最小浓度。如出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。

b6n2抗菌活性测定结果如表2所示。

表2b6n2的抗菌活性

由表2可知，b6n2对沙门氏菌有较强抑制作用，对最强致病性的鼠伤寒沙门氏菌atcc14028的mic值为2μm。

实施例4b6n2对胞外沙门氏菌的量效曲线

方法类似mic测定法。具体如下：

1)挑取供试菌株单克隆至mh培养基，37℃，250rpm，振荡过夜培养；

2)将抗菌药物按2倍mic浓度系列稀释至1.5ml无菌离心管中，浓度分别是终浓度的10倍；

3)以1％的接种量分别将供试菌株转接至mh液体培养基中37℃，250rpm振荡培养至0.5个麦氏标准比浊；

4)稀释供试菌培养液1000倍(最终菌体浓度为105cfu/ml左右)，转移至无菌细胞培养板中，每孔含稀释后菌液90μl；

5)加入稀释后的药物10μl，每个浓度3个平行样，并预留无药物阴性对照孔。加无菌培养板板盖，封口膜封闭后37℃静止培养18-24h后利用平板稀释法计数含有的克隆数。

结果如图3所示，从图3可以看出，在0.25～1倍mic亚抑菌浓度范围内b6n2对鼠伤寒沙门氏菌的的杀菌效果高于n2。

实施例5b6n2对胞内鼠伤寒沙门氏菌(s.t)的杀菌试验

细胞培养至浓度5×10⁵cells/ml，3000×g/min离心10min，pbs洗涤，重复三次，将已培养至对数中期的s.t以感染复数(multiplicityofinfection，moi)10:1感染细胞，于37℃含有5％co2培养箱中共孵育0.5h。pbs冲洗细胞，加入新鲜的含有150μg/l庆大霉素的培养液，37℃孵育2h以杀灭胞外菌。pbs洗涤两次，更换培养基为含不同浓度的b6n2溶液，24h后胞内存活菌体数目涂板计数，其中细胞用加入0.1％bsa和0.1％triton-x的汉克斯缓冲盐溶液(hanksbufferedsalinesolution)裂解，裂解物在含有0.05％tween-20的bsa溶液中逐级稀释后涂板计数。结果见图4和表3。

表3b6n2的胞内杀菌活性

由表3可见，50μmb6n2相对于50μm和100μm的n2分别提高了83.3％和47.2％；100μmb6n2相对于50μm和100μm的n2分别提高了94.3％和82.1％。充分表明了偶联b6后n2的穿膜效率大幅度提升。

实施例6b6n2的细胞穿膜实验

六孔细胞培养板，接种raw264.7细胞，密度为2×10⁵个/孔，培养过夜(约16h)，在细胞贴壁后，更换新鲜培养液，30min后，去掉培养液，更换含有一定浓度用fitc标记的b6n2的1640或dmem培养基(无血清，无双抗)1.5ml。孵化一定时间后，加入1.5umhoechst33342染色5min-10min后，用pbs洗涤2-3次。分别在488nm和543nm的激发光下用荧光显微镜观察。

结果如图5所示，从图5可以看出，带有fitc标记的b6n2进入细胞质较多，亮度较强，相反，n2进入细胞的仅有部分粘附在细胞膜上，这证明了连接blfcin6促进了n2的入胞作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京生泰云科技有限公司

<120>嵌合穿膜抗菌肽b6n2及其应用

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