的菌种转接至另一 PDA培养基，27 °C培养10 d;将获得的菌落用无菌 水洗下，制得斑点叶点霉孢子悬液，并稀释至IO5Cfu / mL。
[0027] 实施例3 枯草芽孢杆菌JK05菌液的制备：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体 培养基进行活化（27 °C);将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，27 °C、130 r / min 条件下培养24 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基(接种量为5 %)，于27 °C、 130 r / min条件下培养96 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到IO9 cfu / mL以上。
[0028] 实施例4 枯草芽孢杆菌JK05菌液的制备：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体 培养基进行活化（30 °C);将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，30 °C、120 r / min 条件下培养18 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基(接种量为2. 5 %)，于30 °C、 120 r / min条件下培养72 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到IO9 cfu / mL以上。
[0029] 实施例5 枯草芽孢杆菌JK05菌液的制备：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体 培养基进行活化（37 °C);将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，37 °C、110 r / min 条件下培养12 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基(接种量为I %)，于37 °C、 110 r / min条件下培养48 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到IO9 cfu / mL以上。
[0030] 实施例6 枯草芽孢杆菌JK05抗太子参叶斑病能力的作用效果分析。
[0031] 于盆钵中栽培太子参种苗，盆栽分为四组，每组30株并设三个重复，各组的处理 方法如表1所示。菌液及无菌水喷施方法为：将实施例3中制备的枯草芽孢杆菌JK05菌液 稀释至IO 7 cfu / mL，并取50 mL均勾喷施于参苗以及参苗根周土壤，无菌水喷施方法亦相 同。病原菌接种方法为：选取参苗植株上部的四片叶片，采用针刺法产生伤口，然后在有伤 口的叶片表面喷洒病原菌孢子悬液(喷洒量为2 mL /株)，喷洒病原菌孢子悬液在喷施无 菌水或菌液3天后进行。接种病原菌后，每天观察太子参叶斑病的发病情况与程度，并统计 感病率和感病指数。
[0032] 表1各组参苗处理方法
根据接种叶片正反两面出现病斑的数量及直径进行病情分级，分级标准如表2所示。
[0033] 表2病株的分级标准
统计时，按叶片发病程度分别将其归入合适的等级中，根据以下公式进行感病率和感 病指数的计算： 感病率=(感病株数/接种株数）X 100% 感病指数=Σ (各级病株数X该级代表数值)XlOO /(总株数X最高一级代表数值） 经观察和统计，供试参苗的感病率和感病指数结果如图2所示。
[0034] 实施例7 枯草芽孢杆菌JK05抗太子参叶斑病能力的作用效果分析。
[0035] 于盆钵中栽培太子参种苗，盆栽分为四组，每组30株并设三个重复，各组的处理 方法如表3所示。菌液及无菌水喷施方法为：将实施例4中制备的枯草芽孢杆菌JK05菌液 稀释至IO6 cfu / mL，并取100 mL均勾喷施于参苗以及参苗根周土壤，无菌水喷施方法亦 相同。病原菌接种方法为：选取参苗植株上部的四片叶片，采用针刺法产生伤口，然后在有 伤口的叶片表面喷洒病原菌孢子悬液(喷洒量为2 mL /株)，喷洒病原菌孢子悬液在喷施 无菌水或菌液3天后进行。接种病原菌后，每天观察太子参叶斑病的发病情况与程度，并统 计感病率和感病指数。
[0036] 表3各组参苗处理方法
根据接种叶片正反两面出现病斑的数量及直径进行病情分级，分级标准如表4所示。
[0037] 表4病株的分级标准
统计时，按叶片发病程度分别将其归入合适的等级中，根据以下公式进行感病率和感 病指数的计算： 感病率=(感病株数/接种株数）X 100% 感病指数=Σ (各级病株数X该级代表数值)XlOO /(总株数X最高一级代表数值） 经观察和统计，供试参苗的感病率和感病指数结果如图3所示。
[0038] 实施例8 枯草芽孢杆菌JK05抗太子参叶斑病能力的作用效果分析。
[0039] 于盆钵中栽培太子参种苗，盆栽分为四组，每组30株并设三个重复，各组的处理 方法如表5所示。菌液及无菌水喷施方法为：将实施例5中制备的枯草芽孢杆菌JK05菌液 稀释至IO 8 cfu / mL，并取20 mL均匀喷施于参苗以及参苗根周土壤，无菌水喷施方法亦相 同。病原菌接种方法为：选取参苗植株上部的四片叶片，采用针刺法产生伤口，然后在有伤 口的叶片表面喷洒病原菌孢子悬液(喷洒量为2 mL /株)，喷洒病原菌孢子悬液在喷施无 菌水或菌液3天后进行。接种病原菌后，每天观察太子参叶斑病的发病情况与程度，并统计 感病率和感病指数。
[0040] 表5各组参苗处理方法
根据接种叶片正反两面出现病斑的数量及直径进行病情分级，分级标准如表6所示。
[0041] 表6病株的分级标准
统计时，按叶片发病程度分别将其归入合适的等级中，根据以下公式进行感病率和感 病指数的计算： 感病率=(感病株数/接种株数）X 100% 感病指数=Σ (各级病株数X该级代表数值)XlOO /(总株数X最高一级代表数值） 经观察和统计，供试参苗的感病率和感病指数结果如图4所示。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌其保藏单位为中国典型培养物保藏 中心（CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO: M 2014595。2. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（AaciBy1S MkiB1S) JK05在抗太子参叶斑病 中的应用。3. 根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌Az1S MkiB1S) JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，所述应用具体为：将枯草芽孢杆菌JK05进行液体发酵制备成菌 液，直接喷施于太子参植株及根周土壤，施用菌液后进行正常的田间管理。4. 根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌MkiB1S) JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，所述菌液的施用浓度为IO6-IO8 cfu / mL，施用量为20-100 mL / 株。5. 根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌Az1S MkiB1S) JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌JK05菌液按如下方法制备得到：将冰箱保存 的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体培养基进行活化；将活化后的菌株JK05接种至 LB液体培养基，培养获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基，培养获得JK05菌液，其 中JK05芽孢数达到IO 9 cfu / mL以上，用于太子参植株及根周土壤的喷施。6. 根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌JK05活化所需温度为27-37°C。7. 根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌Az1S JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，所述活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基后的培养条件为 27-37 °C、110_130 r / min 条件下培养 12-24 h。8. 根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌Az1S JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，种子液接种至LB液体培养基的接种量为1-5%。9. 根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌Az1S JK05在抗太子参叶斑 病中的应用，其特征在于，种子液接种至LB液体培养基，于27-37 °C、110_ 130 r / min条 件下培养48-96 h获得JK05菌液。
【专利摘要】本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在抗太子参叶斑病中的应用，属于微生物技术领域；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05，该菌株已于2014年11月25日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）登记保藏，保藏号为CCTCC NO: M2014595；经平板对峙法测定，菌株JK05对太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的抑制率达到80.33%；本发明同时公开了一种枯草芽孢杆菌在抗太子参叶斑病中的应用；喷施枯草芽孢杆菌JK05菌液可显著降低太子参叶斑病的感病率和感病指数；本发明对于减少化学农药在太子参栽培管理过程中的使用有积极作用，且枯草芽孢杆菌JK05培养条件简单，培养周期短，易于工业化生产及保存，具有良好的开发应用前景。CCTCC NO: M201459520141125
【IPC分类】A01G7/06, C12R1/125, A01P3/00, A01N63/00, C12N1/20
【公开号】CN104946553
【申请号】CN201510071402
【发明人】郭丹钊, 韩邦兴, 顾凯华, 杨丹丹, 王亚
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年2月11日