判断:出现308bp的单一扩增条带，则说明样品种含有TSHSV ;反之，则样品中不含TSHSV。
[0046]【具体实施方式】2
荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒操作流程为:
Cl)阳性对照样品及标准液配制:阳性对照样品的制备同【具体实施方式】21步骤(I)中的阳性模板。使用时，用无核糖核酸酶水将阳性对照样品稀释，即稀释成浓度分别为1.0X10S、L 0Χ107、1.0Χ106、1.0Χ105、1.0 X 14拷贝/μ I的标准液，作为阳性对照样品标准曲线制作的反应模板。(2)待测样品RNA提取:取20-30mg病毒感染的中华鳖肺、脾、肾等组织匀浆，加入350-500 μ L裂解液匀浆，离心；取上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；用(无核糖核酸酶水，洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA。 (3)阴性对照样品:健康中华鳖组织RNA 500-1000ng/yLo后续使用同待测样品RNA。 (4)病毒核酸反转录反应体系及条件:所述反应液总体积为10-20 μ L，包括反应液A和反应液B。
[0047]配制反应液Α，包括:0.2-0.4ymol/L 引物 Olig (dT) 15 (Takara，大连来源)，1-3 μ g上述步骤(2)提取的病毒RNA作为模板，70°C 5min后冰浴2min。配制反应B液，包括:30-50mmol/L 的 ρΗ8.0-8.5Tris_HCl，50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，2-10mmol/L 二硫苏糖醇，l_2mmol/L dNTP，10-15% DMSO (体积分数)，5_15% PEG-6000(质量分数)，0.1-0.2 μ g/μ L BSA (Takara，大连来源)，10_20U RNase 抑制剂(Takara，大连来源)，50-200U的MMLV反转录试剂(Takara，大连来源);待反应液A按上述条件处理后，加入反应液B，混匀，42°C反应I h得反转录产物。反转录产物稀释5-10倍作为后续荧光定量RT-PCR的模板。(5) PCR扩增反应体系:所述反应体系为20-50 μ L，配制反应液包括:10-15mmol/L 的 pH8.0-8.5Tris-HCl, 50_80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，l-2mmol/L dNTP，20_200nmol/L TSHSV-F2 引物，20-200 nmol/L TSHSV-R2 引物，0.3-0.5ulSybGREEN荧光染料，1_5 yL步骤(4)稀释后的反转录产物，1-3U热启动DNA聚合酶。将加样后的PCR试剂管放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应循环程序为:93-99°C预变性1min, 93-99°C 30s, 58-60°C 15s，70-74。。30s，35-40 个循环。(6)荧光 PCR 仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成获得各样品CT值，并经阳性对照样品的标准曲线制作，可获得样品的病毒含量。
[0048]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1.一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，其特征在于:包括用于普通RT-PCR的特异性扩增引物和用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物，所述用于普通RT-PCR的特异性扩增引物为引物对TSHSV-Fl和TSHSV-R1，TSHSV-Fl的核苷酸序列为SEQ ID No:1所示，TSHSV-Rl的核苷酸序列为SEQ ID No:2所示；所述用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物为引物对TSHSV-F2和TSHSV-R2，TSHSV-F2的核苷酸序列为SEQ ID No:3所示，TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No:4所示。2.—种检测中华鳖出血病病毒的普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于:包括反转录反应液和PCR扩增反应液，20-50 yL的PCR扩增反应液包括:10-15mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50_80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，l_2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F1 引物，20_200nmol/L TSHSV-Rl 引物，1-3U DNA 聚合酶，1-4 μ L 反转录产物；TSHSV-Fl的核苷酸序列为SEQ ID Νο:1所示，TSHSV-Rl的核苷酸序列为SEQ IDNo: 2所示。3.根据权利要求2所述的普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于:所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20 μ L中反应液A的体积为5-10 μ L，余量为反应液B ;反应液A包括:0.2-0.4 ymol/L引物Olig (dT) 15，1-3 μ g待检样品 RNA作为模板；反应液 B 包括:30-50mmol/L 的 pH8.0-8.5Tris_HCl，50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，2-1OmmoI/L 二硫苏糖醇，l_2mmol/L dNTP，10_15vol% DMSO，5-15wt% PEG-6000,0.1-0.2 μ g/μ L BSA，10-20U RNase 抑制剂，50-200U的 MMLV反转录试剂。4.一种检测中华鳖出血病病毒的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于:包括反转录反应液和荧光定量PCR扩增反应液，20-50 μ L的荧光定量PCR扩增反应液包括:10-15mmol/L 的 ρΗ8.0-8.5Tris_HCl，50_80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，l-2mmol/L dNTP，20_200nmol/L TSHSV-F2 引物，20_200n mol/L TSHSV-R2 引物，0.3-0.5 μ L SYBGreen荧光染料，1-5 μ L稀释后的反转录产物，1-3U热启动DNA聚合酶；TSHSV-F2的核苷酸序列为SEQ ID No:3所示，TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No:4所不O5.根据权利要求4所述的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于:所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20 μ L中反应液A的体积为5-10 μ L，余量为反应液B ;反应液A包括:0.2-0.4 μ mol/L引物Olig (dT) 15，1-3 μ g待检样品 RNA作为模板；反应液 B 包括:30-50mmol/L 的 pH8.0-8.5Tris_HCl，50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，2-1OmmoI/L 二硫苏糖醇，l_2mmol/L dNTP，10_15vol% DMSO，5-15wt% PEG-6000,0.1-0.2 μ g/μ L BSA，10-20U RNase 抑制剂，50-200U的 MMLV反转录试剂。6.根据权利要求4所述的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，其特征在于:稀释后的反转录产物为反转录产物稀释5-10倍所得。
【专利摘要】本发明公开了一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒，其目的在于克服现有引发中华鳖爆发性死亡的病毒性病原无法确诊的局限，提供一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，采用该特异性扩增引物检测中华鳖出血病病毒，检测结果特异，结果易判断，有利于中华鳖病毒病的确诊。同时本发明还提供了包含上述引物的检测中华鳖出血病病毒的检测试剂盒，具有普通RT-PCR和荧光定量RT-PCR两种，两种试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105039324
【申请号】CN201510396737
【发明人】刘莉, 叶雪平, 林锋, 曹铮, 周冬仁
【申请人】浙江省淡水水产研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月8日