[0067]已知烟曲霉anxC4基因是真菌膜联蛋白家族的成员，但其具体功能尚不清楚。发明 人前期研究中分析出烟曲霉的anxC4基因序列与其它真菌及人类的同源基因序列有显著差 异。利用该差异，发明人提出可将烟曲霉膜联蛋白anxC4及其基因（anxC4基因）作为理想特 异性检测靶标，用于烟曲霉检测方法的研究。该分析得到了实例验证，以下详述。
[0068] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（《分子克隆实验指南》）[Sambrook，J·， Russell?David ff.?Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY， Cold Spring Harbor·]〇
[0069] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、质 量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
[0070] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0071]所用引物均由华大基因公司合成。
[0072]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述实施例。
[0073] -、anxC4基因在烟曲霉的LAMP检测中检测模板的应用
[0074]实施例1 -1、设计烟曲霉的LAMP检测引物
[0075] 从 NCBI 的核酸数据库 GenBank(http: //www.ncbi.nim.nih· gov)检索获得烟曲霉 (A. fumigatus)膜联蛋白anxC4基因（anxC4)序列（GenBank:AY598940 · 1)，通过BLAST软件进 行同源性分析，获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因为烟曲霉的特异性保守序列（序列表中SEQ ID NO: 1，为anxC4基因全长，它相对其他真菌和人是特异性的，因此作为检测模板），再根据 该特异性保守序列（SEQ ID N0: 1)，用软件Primer Explorer version4(http:// primerexplorer. jp/e)设计用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物组合，共设计出30多套引物 组合(其中部分如表2所示），通过敏感性和特异性检测筛选出性能最佳的一套引物，该引物 组合的序列如表1所示。
[0076] 表1用于对烟曲霉进行LAMP检测的引物组合
[0077]
[0078] 表2:用于对烟曲霉进行LAMP检测的部分引物组合
[00791
Γηη?η?
[0081 ] 实施例1-2、建立烟曲霉的LAMP检测方法
[0082] -）、构建携带烟曲霉(A.fumigatus)膜联蛋白ANXC4基因（anxC4)的克隆质粒(标 准品）
[0083] 根据烟曲霉(A · fumigatus)膜联蛋白anxC4基因（anxC4)的核苷酸序列（Gen Bank: AY598940 . 1 )设计PCR扩增烟曲霉anxC4基因的引物（上游引物F序列：5 ' -TCGCCAAATCTTCGACCAGT-3 '，下游引物B序列：5 '-GGTCTGGCATAGCTGGGATG-3 '），用改进后的 十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB)(Attitalla IH.Modified CTAB metho d for high quality genomic DNA extraction from medicinal plants.Pak J Bi ol Sci.201INov 1; 14(21): 998-9.)提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，再以烟曲霉的基因组DNA为模板， 在引物F和B的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系为50yL(10 X PCR反应缓冲液5yL，200μΜ dNTPs 4μL，10μΜ引物均加 10yL，Ta q DNA polymerase 2.5U，模板DNA为20-200ng，用ddH20 补齐至50yL)，PCR反应条件为95°C预变性5min、30个循环扩增(95°C变性30s、56°C退火30s、 72 °C延伸30s)、72°C加热lOmin，反应结束后回收PCR扩增产物，将其连接到载体PMD19-T(购 自TaKaRa)中，将连接产物转化到JM109感受态细胞中（转化方法为氯化钙法），用蓝白斑筛 选的方法筛选出阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了长度为 275bp的烟曲霉anxC4基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0 :6所示（SEQIDN0:6为插 入到标准品质粒中的目的序列），而且烟曲霉anxC4基因成功连接入载体PMD19-T中的EcoRv 克隆位点，与预期结果相符，将携带烟曲霉anxC4基因的重组载体命名为PMD19-T-anxC4,其 物理图谱如图1 -1所示。将携带PMD19-T-a nxC4的阳性克隆接入液体沙氏培养基中，在室 温、300rpm条件下振荡培养12-16小时，培养结束后提取质粒，得到携带烟曲霉膜联蛋白 anxC4基因(anxC4)的克隆质粒(标准品，其物理图谱如图2-2所示）。
[0084]二）、确定用于烟曲霉LAMP检测的最佳反应体系
[0085]用实施例1-1优选的引物组合对烟曲霉(ATCC13073)进行LAMP检测，以获得最佳反 应体系，具体方法如下：
[0086] 1)在实施例1-1优选的引物组合的引导下进行LAMP扩增，25yL LAMP反应液包括： 待测样品基因组DNA 2yL，2 X反应缓冲液12.5yL，Bst DNA聚合酶(8000U/ml) lyL，去离子水 5 · 5yL，引物加入量为：5pmol 引物F3lyL，5pmol 引物B3lyL，40pmol 引物FIP lyL，40pmol 引物 BIP lyL;LAMP扩增条件为:置63°C恒温60min，为了使Bst DNA聚合酶失活，扩增结束后还需 80°C保持5min;所述LAMP检测方法中还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉 标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP反应体系，如双蒸水、无菌去离子水(优 选)。
[0087] 2)反应结束后结果可用以下三种方法进行判定：
[0088] 2.1用浊度仪检测LAMP扩增前后反应液的浊度变化，根据浊度变化判断结果:池度 上升表示待测样品中存在烟曲霉（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在烟曲霉（阴 性)；
[0089] 2.2在LAMP反应液中添加 SYBR Green I染液，根据LAMP扩增前后反应液的颜色变 化判断结果:绿色表示待测样品中存在烟曲霉（阳性），橙色表示待测样品中不存在烟曲霉 (阴性）；
[0090] 2.3对LAMP扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳条带并 判断结果：出现连续阶梯式的图谱表示待测样品中存在烟曲霉（阳性），未出现连续阶梯式 的图谱表示待测样品中不存在烟曲霉（阴性）。
[0091] 根据上述实验确定了最佳的烟曲霉的LAMP反应液（25yL)包括:待测样品基因组 DNA 2yL，2 X反应缓冲液12.5yL，Bst DNA(8000U/ml)聚合酶lyL，去离子水5.5yL，引物加入 量为：5pmol 引物F31yL，5pmol 引物B31yL，40pmol 引物FIP lyL，40pmol 引物BIP lyL。
[0092] 三）、确定用于烟曲霉LAMP检测的最佳扩增条件
[0093] 用实例1优选的引物组合对烟曲霉进行LAMP检测，以获得最佳扩增条件，具体方法 如下：
[0094] 1)在实施例1-1优选的引物组合的引导下进行LAMP扩增，25yL LAMP反应液包括： 与步骤二相同；LAMP扩增条件为:置60-65 °C恒温60min，为了使Bst DNA酶失活，反应结束后 还需80°C保持5min;
[0095] 2)反应结束后进行结果判定:与步骤二相同。
[0096] 结果在60-65Γ恒温60min的LAMP扩增条件下，优选的引物组合均取得了较好的反 应效果，特别是在63°C恒温60min的LAMP扩增条件下，扩增效果最好;扩增结束后还需80°C 保持5min〇
[0097] 上述实验确定最佳的检测烟曲霉的LAMP扩增条件为:置60-65°C恒温60min，优选 为置63°C恒温60min，反应结束后80°C保持5min。
[0098] 实施例1-3、烟曲霉的LAMP检测方法的特异性检测
[0099] 分别以烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念 珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青 霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄 色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌（以上菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制 中心）、人肺腺癌细胞A549(Human)的基因组DNA为模板，以携带烟曲霉膜联蛋白ANXC4基因 (anxC4)的克隆质粒为标准品，以无菌去离子水为阴性对照，在实例1优选的引物组合和实 例2最佳反应体系和反应条件下检测烟曲霉LAMP检测方法的特异性。
[0100]琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1_2(3、4、25:烟曲霉（阳性对照），1、2、26阴性对照， 5:黄曲霉，6:黑曲霉，7:土曲霉，8:构巢曲霉，9:杂色曲霉，10:白色念珠菌，11:热带念珠菌， 12:近平滑念珠菌，13:克柔念珠菌，14:光滑念珠菌，15:浅白隐球菌，16:指甲隐球菌，17: 新生隐球菌，18:桔青霉，19:马内菲青霉，20:棘状外瓶霉，21:皮炎外瓶霉，22:荚膜组织胞 浆菌，23:尖孢镰刀菌，24:红色毛癣菌，27:金黄色葡萄球菌，28:鲍曼不动杆菌，29:人肺腺 癌细胞A549 (Human )，其中3、4、2 5是阳性对照)所示，从图中可以看出，琼脂糖凝胶电泳检测 结果显示：只有3、4、25(烟曲霉）出现连续阶梯式的图谱（阳性），其余均未出现连续阶梯式 的图谱（阴性），且未出现假阳性。
[0101] 浊度仪检测结果和SYBR Green I检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致。
[0102] 上述检测结果说明，本发明的LAMP引物组合能特异地扩增出烟曲霉膜联蛋白 anxC4基因（anxC4)的革E1序列，而不与其它细菌或人(Human)的基因组DNA发生交叉反应，说