专利名称：含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用。
背景技术：
血吸虫病是分布最广泛、危害最严重的被忽略热带疾病之一，我国流行的是日本血吸虫 病，其病原体为日本血吸虫。日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)的生活周期复杂， 有钉螺作为其中间宿主和人、水牛、黄牛等哺乳动物作为其终末宿主。近年来，对于血吸虫 生命活动的分子机制和其重要功能分子的研究受到越来越多的关注，其中热休克蛋白(Heat shock proteins, Hsp)便是一类重要的功能分子，它是很多生命活动的参与者。热休克蛋白 是一类高水平基础表达的蛋白质，占正常生长条件下所有类型细胞中蛋白总量的5%-10%。当 细胞处于逆境时，热休克蛋白的表达量明显上调。Hsp60是热休克蛋白的家族之一，是一种 在细胞保护中起重要作用的分子伴侣。真核生物的Hsp60主要定位于线粒体，另有一小部分 存在于胞浆。线粒体中的Hsp60可作用于凋亡相关因子而抑制线粒体凋亡通路的激活，并且能 够减少线粒体产生氧自由基；胞浆中的少量Hsp60亦可通过与凋亡相关因子的相互作用等途 径抑制细胞凋亡。作为分子伴侣，Hsp60帮助变性和不可溶的蛋白聚集体恢复正确构象。正 常条件下，Hsp60以稳定状态存在于线粒体基质和胞浆中；应激条件下，Hsp60迅速从胞浆转 移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白。张玲等用吡喹酮对日本血吸虫成虫进行体 外作用，采用二维-纳喷雾-液相色谱联合串联质谱的方法，发现经吡喹酮作用后，Hsp60和 Hsp70蛋白明显上调，提示热休克蛋白可能参与缓解吡喹酮对细胞损害的作用，导致生物体 合成这类蛋白质的能力增强。由此推测，抑制热休克蛋白基因表达或抑制热休克蛋白活性以 减少其他多种蛋白的合成可能能够作为一种抗血吸虫的新途径。
疫苗是控制传染性疾病的有效手段，也是血吸虫病综合防治的重要措施之一，世界卫生 组织专家认为，短效的化疗手段必须与长效的疫苗措施相结合。尽管目前所有实验性血吸虫 病疫苗在免疫后均只能诱导出对血吸虫感染部分抵抗力，但由于血吸虫在其终宿主体内不繁 殖，故对控制血吸虫病仍有重要的生物学与临床意义。寻找新的疫苗候选抗原仍是当今血吸 虫疫苗研究的重点之一。
到目前为止，还没有出现关于本发明日本血吸虫热休克蛋白60作为疫苗应用的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，该重组载体表 达的日本血吸虫热休克蛋白60可作为抗血吸虫的疫苗候选抗原。
此外，还需要提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的 疫苗中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现
在本发明的一个方面，提供了一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是闩本 血吸虫热休克蛋白60基因。
优选的，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因序列是编码SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的 核苷酸序列；更优选的，该日本血吸虫热休克蛋白60基因序列为SEQ IDN0:2所示核苷酸序 列。
优选的，所述表达载体为原核表达载体更优选的，所述表达载体为原核表达载体 pET28a(+)。
在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。 在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫热休克蛋白60的制备方法，包括以下歩
骤
构建含日本血吸虫热休克蛋白60基因的重组表达载体；
将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；
培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表 达日本血吸虫热休克蛋白60;
纯化诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60。
优选的，所述诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60还连接有包含6个组氨酸的标签序列。 在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫 苗中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的 应用。
本发明重组载体表达的日本血吸虫热休克蛋白60可以作为诊断抗原对血吸虫病畜进行 诊断。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述制备方法生产的日本血吸虫热休克蛋白60作为 预防或治疗血吸虫病疫苗的用途。
本发明含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达闩本血吸虫热休克蛋白60，该高表达的重组日本血吸虫Hsp60蛋白在小鼠免疫性保护实验中，使免疫组小鼠的减虫率与肝组 织减卵率分别达到28. 76%和24. 85%，表明本发明重组曰本血吸虫Hsp60蛋白能诱导小鼠产生 一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1重组质粒的酶切与PCR鉴定图2是本发明实施例2重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)后经IPTG诱导表达结果图； 图3是本发明实施例3重组日本血吸虫h印60蛋白表达形式的鉴定与纯化图。
具体实施例方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明利用重组DNA技术将日本血吸虫热休克蛋白60 (hsp60)基因的编码序列克隆至 原核表达载体，并使其在大肠杆菌中大量表达，且纯化得到其表达产物。纯化产物可应用于小 鼠免疫保护实验，以评估其抗血吸虫的保护效果，为抗血吸虫病疫苗分子的筛选提供重要的 参考价值。
实施例1 日本血吸虫hsp60基因编码序列原核表达载体的构建 査找日本血吸虫hsp60基因在Genebank中的序列设计引物，用DNAstar分析其序列特征，
并找到其最大的开放阅读框(SEQ ID N0:2)，即其编码蛋白质的序列部分，根据这一部分序
列设计引物如下
sense: 5， -CCGGGATCCATGTTACGAGCTCTAAGTTCA_3， ( SEQ ID NO:3)， anti-sense:5， -GCGCTCGAGCATCATGCCTCCCATTCCA-3' ( SEQ ID NO:4)， 分别引入限制性内切酶BamH I和Xho I酶切位点(下划线部分)。Hsp60开放阅读框的扩增 以闩本血吸虫雌虫cDNA文库为模板进行PCR。采用的原核表达载体pET28a(+)为表达6XHis标 签的高效表达载体，该载体设计有多克隆酶切位点，可以插入外源基因片段hsp60基因编码序 列。将扩增hsp60基因编码序列的PCR产物经胶回收、双酶切后，与同样双酶切的质粒pET28a(+) 于16。C连接过夜，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，均匀涂布于含有卡那霉素(100ug/ml) 的LB平板上。挑取单一菌落扩大培养，提取质粒，进行PCR及单、双酶切鉴定，将初步鉴定正 确的阳性克隆菌液进行测序。
图l为重组质粒Sjhsp60-pET28a(+)的酶切与PCR鉴定图，在图l中，Ml: DNA标志物 (DL15000); h重组质粒BamH I单酶切鉴定；2:重组质粒BamH I 、 Xhol I双酶切鉴定；3:
5重组质粒PCR鉴定；M2: DNA标志物(DL2000)。从图l可以看出，在"2"、 "3"泳道都有明显 的1725bp大小的hsp60条带，表明经PCR扩增出的hsp60基因片段，成功地插入了原核表达载体 pET28a(+)的多克隆酶切位点。
重组质粒DNA经测序得知，重组质粒中插入片段的序列与Genebank中公布的日本血吸虫 SJCHGC09129蛋白mRNA完整编码区完全一致，达到100%的吻合度，且与曼氏血吸虫热休克蛋白 60的mRNA也有81W的吻合度，可以证明本发明成功地将日本血吸虫hsp60的编码序列插入了原 核表达载体，且插入方向正确。
实施例2日本血吸虫hsp60基因原核表达载体的诱导表达
将测序正确的阳性克隆的质粒S jhsp60-pET28a (+)转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞 中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，挑取单一菌落，鉴定正确后接种于液体LB培养基中， 待达到对数生长期后，加入异丙基-13-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为lmM/L)进行诱导表 达，分别收集诱导前及诱导后lh、 2h、 4h及6h的菌液，用十二垸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE电泳，5。/。浓縮胶80V电压，127。分离胶120V电压)分析验证。
结果如图2所示，在图2中，M:蛋白质标志物；1:未诱导的菌液；2:诱导后lh; 3:诱 导后2h; 4:诱导后4h; 5:诱导后6h。从图2可以看出，诱导前及诱导后各时相，经过SDS-PAGE, 其中l条带随着诱导时间的延长而增宽，4h达最大，该条带与目的蛋白大小Mr67000Da相近(闩 本血吸虫hsp60基因所编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:l所示，其相对分子质量约为62000Da， 表达出的产物为包含有部分载体序列的6个组氨酸标签和插入片段Sjhsp60基因所编码的蛋白 质的融合体rSjhsp60，该融合体蛋白的相对分子质量约为67000Da)。可以证实，重组质粒在 大肠杆菌当中获得了高水平的表达。
实施例3 原核表达载体表达产物的纯化
小量诱导重组菌(100ml) ,4。C，4000rpm离心15min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤后，加 入1X结合缓冲液(binding buffer)重悬菌体，反复冻融3次后，超声破碎细胞。将超声 后的悬液于4t:， 12000rpm，离心30min，分别收集上清和沉淀鉴定其表达形式。由图3可知， 重组质粒的表达产物出现在超声后的沉淀中，说明其表达形式为包涵体。在图3中，1:超声 后的上清；2:超声后的沉淀；3:纯化后的蛋白。
利用重组表达的融合体蛋白中的组氨酸和镍离子的亲和性可将该融合体蛋白加以纯化，
纯化步骤按照Novagen His-tag纯化手册进行。
将沉淀用含6M尿素的1X结合缓冲液溶解，4°C， 12000rpm，离心30min，收集上清。用
His.Bind树脂纯化表达产物。具体操作如下
(1)将400pL树脂悬液加入到1.5mL离心管中，低速离心后除去上清。(2) 按以下顺序和次数进行树脂的离子化和平衡。
a. 2倍体积灭菌去离子水，2次
b. 2倍体积1X离子化缓冲液(charge buffer), 3次
c. 2倍体积1X结合缓冲液，2次
(3) 加入前述用尿素溶解后的上清，轻柔混匀，孵育5min， 2000rpm，离心5min，弃上清。
(4) 3倍体积1X结合缓冲液清洗树脂3次。
(5) 3倍体积1X冲洗缓冲液(washing buffer)清洗树脂3次。
(6) 1倍体积1X洗脱缓冲液(stripping buffer)将目的蛋白从树脂上剥离下来。 由图3可知，表达产物rSjhsp60得到了纯化(见图3第"3"泳道箭头所指的条带)，且纯
度较高。
实施例4纯化后表达产物对小鼠的免疫
将6周龄雄性BALB/c小鼠分为两组(实验组和对照组)，每组10只。首次免疫按每只小 鼠10(Vg纯化后的日本血吸虫hsp60 (rSjhsp60)与206佐剂混合的乳剂，皮下注射。每隔 14天同样剂量进行第二次和第三次免疫。用PBS与206佐剂的混合乳剂以同样方法处理对照 组小鼠。
第三次免疫一周后，每只小鼠攻击日本血吸虫尾蚴40条。
感染后42天将两组小鼠剖杀，肝门静脉冲虫，计算减虫率。同时每只小鼠取0.5g肝脏， 匀浆后，经氢氧化钾消化后进行肝组织虫卵计数，计算减卵率。通过对减虫率与减卵率的分 析，评估本发明重组日本血吸虫hsp60蛋白作为抗原的免疫保护效果。
减虫率=(1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数)X100%
减卵率=(1-免疫组平均卵荷数/对照组平均卵荷数)X100%
结果如下表l所示，rSjhsp60实验组的减虫率与减卵率分别为28. 76%和24. 85%，表明 rSjhsp60能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用，本发明重组抗原rSjhsp60
具有一定的免疫保护效果。
表1 rSjhsp60免疫小鼠的减虫率和减卵率
平均虫荷数减虫率t检验平均卵荷减卵率t检验(p
(x土s)(%)数(x士s)(%)< 0. 05)
实验组12. 00±2.828. 76p<0. 052568924. 85p<0. 05
对照组18.20±3. 1一一34184—一
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所
<120>含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用
<160> 4
<]70> Patentln version 3.3
<2丄0> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> Schistosoma japonicum
<400> 1
Met Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu 1 5 Gin Lys Val Val Gin Arg Phe Tyr 20
Asp Ala Arg Ser Ala Met Leu lie 35 40 Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys
50 55 Ser Trp Lys Ser Pro Lys lie Thr 65 70 Gly lie Glu Leu Lys Asp Lys Phe 85
Gin Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn 100
Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ala 115 120 lie Ser Lys Gly Ala Asn Pro lie
130 135 Ala Val Asp Ala Val Val Lys Glu 145 150 Ser Thr Pro Glu Glu lie Ala Gin 165
Asp Lys Ala lie Gly Asp Leu lie 180
Asn Asp Gly Thr lie Thr Val Lys 195 200 Leu Glu Phe lie Glu Gly Met Lys
210 215 Tyr Phe lie Asn Thr Glu Lys Gly 225 230 Phe lie Leu Phe Ser Glu Lys Lys 245
Pro Ala Leu Glu Leu Cys His Gin 260
Ala Lys Asp Val Glu Gly Glu Ala
Arg Gly Ser Leu Val Pro Ala Arg
10 15 Ala Lys Glu Val Lys Phe Gly Ala 25 30 Gly Val Asp Val Leu Ala Asp Ala 45
Gly Arg Asn Val lie lie Glu Ser 60
Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys
75 80 Gin Asn lie Gly Ala Lys Leu Val
90 95 Glu Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr 105 110 lie Ala Lys Glu Gly Phe Glu Lys 125
Glu Phe Arg Arg Gly Val Met Leu 140
Leu Lys Ser Phe Ser Lys Gin lie 155 160 Val Ala Thr lie Ser Ala Asn Gly
170 175 Ala Ser Ala Met Lys Arg Val Gly 185 190 Asp Gly Lys Thr Leu His Asp Glu 205
Phe Asp Arg Gly Tyr lie Ser Pro 220
Ala Arg Cys Glu Phe Gin Asp Ala 235 240 lie Asn Ser lie Gin Thr Leu Leu
250 255 Gin Lys Arg Pro Leu Leu lie "lie 265 270 Leu Thr Ala Leu Val Leu Asn Axg
9Leu Lys 290 Gly Asp 305
Gly lie
Thr Thr
Arg Leu
Thr Tyr 370 Met Lys 385
Val Ala
Lys Lys
Glu Glu
Pro Val 450 Val Arg 舰
His Asn
Met Ser
Met lie
Leu Val 530 Val Val 545
Met Gly
275 Leu
Asn
Val
Ala
Phe 355 Arg
Lys
Val
Asp
Gly 435 Leu
lie
Ala
Gin
Glu 515 Asp
Thr
Gly
Gly
Arg
Phe
Arg 340 Thr
His
Glu
lie
Arg 420 lie
Asp
Val
Gly
Asn 500 Ala
Ala
Asp
Met
Leu
Glu
Gly 325 Phe
Asn
Lys
Lys
Lys 405 丁yr
Val
Thr
Leu
Val 485 Met
Gly
Ala
Leu
Gly 565
Gin
Lys 310 Thr
Gly
Ala
Leu
Met 390 Val
Thr
Pro
Leu
Arg 470 Asn
Gly
lie
Gly
Pro 550 Gly
Val 295 Tyr
Lys
Thr
Arg
Lys 375 His
Gly
Asp
Gly
Ser 455 Ala
Ala
Tyr
lie
Val 535 Lys
Met
280 Cys
lie
Gin
Cys
Ser 360 Met
Glu
Gly
Ala
Gly 440 Thr
Leu
Ser
Asp
Asp 520 Ala
Glu
Gly
<210> 〈211> <212> 〈213>
〈220〉 <221> <222>
2
1725 膽
Schistosoma japonic咖
CDS
(l).. (1725)
285
Ala Val Lys Ala Pro Lys Val Phe 300
Lys Arg Tyr Gly Cys Ser Asn Arg 315 320 lie Phe Val Gin Val Arg Gly Cys
330 335 Phe Arg Ser Cys Asn Asn Lys Arg 345 350 Trp Lys Gin Asn Gly His Arg Gin 365
Lys Trp Lys Pro Pro Thr Ala Ser 380
Arg Leu Ala Lys !>eu Ser Asn Gly 395 400 Ser Ser Glu Val Glu Val Ser Glu
410 415 Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala lie 425 430 Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys lie 445
Lys Asn Glu Asp Gin Arg Thr Gly 460
Ser Thr Pro Cys Tyr Thr lie Ala 475 480 Val Val Val Glu Lys Val Lys Gly
490 495 Ala Gin Asn Asp Val Tyr Val Asp 505 510 Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala 525
Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Thr 540
Glu Thr Gly Gly Asn Ala Ala Gly 555 560 Gly Met Gly Gly Met Met 570
〈400〉 2atgMet1
caaGin
Asp
gttVal
tcg
Ser
65
ggt
Gly
ttaLeu
Lys
gcaAla
gca
Ala
50
tgg
Trp
attlie
cgetArg
gttVal
卿
Arg
35
gtc
Val
Lys
gagGlu
cag gac gttGin Asp Val
Thr
atailie
getAla145tecSer
gccAla
agtSer130gttVal
acaThr
actThr115aaaLys
gatAsp
CC3
Pro
ggic aag getAsp Lys Ala
aatAsn
ttgLeu
tatTyr225ttcPhe
gatAsp
g明Glu210tttPhe
3talie
ggcGly195tttPhe
atelie
ttgLeu
getAla
gtt
Val
20
tea
Ser
accThr
tctSer
ctgLeu
getAla100gttVal
ggcGly
getAla
g肪Glu
attlie180acgThr
etaLeu5
caaGin
getAla
atgMet
ccaPro
肪g
Lys
85
aac
Asn
ttaLeu
getAla
gttVal
gagGlu165ggcGly
lie
肪cAsn
tttPhe
agt tea cttSer Ser Leu
agg ttt tatArg Phe Tyr
atgMet
ggcGly
aaa
Lys
70
gat
Asp
ttgLeu
cct
Pro
55
a_tc
lie
aagLys
att
lie
40
aaa
Lys
acaThr
ttcPhe
gcgAla
幼tAsn
gtcVal150atalie
Cg3
Arg
cctPro135
Lys
gcaAla
getAla120atelie
gagGlu
caaGin
gac eta ateAsp Leu lie
lie Glu
actThr
tctSer245
actThr
ggtGly
gagGlu230gaaGlu
gttVal
atgMet215
LysLys
cgtArg
gca
Ala
25
ggt
Gly
ggt
Gly
10
aag
Lys
gttVal
2tac acc aacAsn Thr Asn
cagGin
g助Glu105atalie
aat
Asn
90
gag
Glu
getAla
卿Lys200
Lys
ggsGly
aagLys
gccAla
atalie
cgaArg
aacAsn250
agtSer
gaaGlu
ttgLeu
gtgVal
gtt ccaVal Pro
gat gteAsp Val
ggt cgtGly Arg
aaa gatLys Asp
aacAsn
ggg
Gly
75
att
lie
gta
Val
60
gtt
Val
gggGly
aagLys
ctg
Leu
45
ata
lie
ttc
Phe
30
gcg
Ala
atalie
getAla15
gggGly
gstAsp
卿Arg
getAla
getAla
gaa ageGlu Ser
gag ttcGlu Phe
etc
Leu Lys
gtt gcgVal Ala170get teaAla Ser185
gst ggcAsp Gly
ttc gacPhe Asp
Arg
tctSer155
Thr
cgtArg
tgtCys235ageSer
act gttThr Val
get aagAla Lys
get gggAla Gly
aaa gagLys Glu
Arg140tttPhe
lie
get atgAla Met
a朋setLys Thr
ggtGly220g朋Glu
attlie
gatAsp
ggtGly125ggtGly
tcgSer
tecSer
鄉Lys
c Leu205tatTyr
ttcPhe
cagGin
ggtGly110tttPhe
gttVal
鄉Lys
getAla
鄉Arg190ceicHis
atelie
caaGin
acaThr
gccAla
tta
Leu
95
act
Thr
gaaGlu
atgMet
caaGin
aacAsn175gttVal
geitAsp
tctSer
gatAsp
ttaLeu255
a_aa
Lys
80
gta
Val
acaThr
朋gLys
cttLeu
atslie160ggtGly
gggGly
gagGlu
ccaPro
gccAla240ttaLeu
48
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
11cca get etc gaa eta tgc cac caa caa aaa egg ccg ctg ctg a/tt ate 816Pro Ala Leu Glu Leu Cys His Gin Gin Lys Arg Pro Leu Leu lie lie
260 265 270
gcc aag gat gtt gag ggt gaa get ctt aca gca ctt gta eta a^t cgc 864Ala Lys Asp VaJ Glu Gly Glu AIei Leu Thr Ala Leu Val Leu Asn Arg
275 280 285
tta aaa ctg ggc tta cag gtc tgt gca gtc aag gca ccc aag gtt ttc 912Leu Lys Leu Gly Leu Gin Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Lys Val Phe
290 295 300
ggg卵t cgc gaa aaa tac att犯a aga tat ggc tgt昭c aac已gg 960Gly Asp Asn Arg Glu Lys Tyr lie Lys Arg Tyr Gly Cys Ser Asn Arg305 310 315 320
ggt ata gtg ttc ggg acg aag cag ata ttt gtc caa gtt aga gga tgt 1008Gly lie Val Phe Gly Thr Lys Gin lie Phe Val Gin Val Arg Gly Cys
325 330 335
aca act gca aga ttt ggg acg tgt ttc aga age tgt犯t aac aaa aga 1056Thr Thr Ala Arg Phe Gly Thr Cys Phe Arg Ser Cys Asn Asn Lys Arg
340 345 350
cga ttg ttt act aat gcg agg teg tgg a犯c朋EieLt gg￡i ca/t cga caa 1104Arg Leu Phe Thr Asn Ala Arg Ser Trp Lys Gin Asn Gly His Arg Gin
355 360 365
acg ta/t cgc cac a犯tta犯g atg saa tgg aag cct cca a_ca gcg agt 1152Thr Tyr Arg His Lys Leu Lys Met Lys Trp Lys Pro Pro Thr Ala Ser
370 375 380
alg aaa aaa g犯a犯atg cac gaa cgc ttg gcc aag ttg tea aac ggc 1200Met Lys Lys Glu Lys Met His Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asn Gly385 390 395 400
gtc gca gta att aag gtt ggt gga agt agt gaa gta gaa gtt agt gag 1248Val Ala Val lie Lys Val Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Ser Glu
405 410 415
aaa aag gat cga tat act gat gca etc aat gca acg aga gca gca att 1296Lys Lys Asp Arg Tyr Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala lie
420 425 430
gag gaa ggc ata gtg cct ggt ggt ggc act get ttg ctg cga tgc att 1344Glu Glu Gly lie Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys lie
435 440 445
cct gtc ctg gat acg tta tct acc aag aac gaa gat cag cga aca ggt 1392Pro V^l Leu Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp Gin Arg Thr Gly
450 455 460
gtg egg att gtt eta cgt gca ctt tea act ccg tgc tat acc att gca 1440Val Arg lie Val Leu Arg Ala Leu Ser Thr Pro Cys Tyr Thr lie Ala465 470 475 480
cat aac gca ggt gtc aac gcc tct gtt gtc gtt gaa aaa gtc aaa ggt 1488His Asn Ala Gly Val Asn Ala Ser Val Val Val Glu Lys Val Lys Gly
485 490 495
atg age cag aat atg ggt tac gat get caa aat gat gtt tac gtt gat 1536Met Ser Gin Asn Met Gly Tyr Asp Ala Gin Asn Asp Val Tyr Val Asp
500 505 510atg ate gag get ggg att att gac cca act a賜gtc gtc继a act gca 1584Met lie Glu Ala Gly lie lie Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala
515 520 525
ttg gtt gat gca get ggt gtt get tec tta etc aca act gca gaa acc 1632Leu Val Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Thr
530 535 540
gtg gtg acg gat ttEi cca幼a gaa gag acc gga ggc aac gca gca gga 1680Val Val Thr Asp Leu Pro Lys Glu Glu Thr Gly Gly Asn Ala Ala Gly545 550 555 560
atg ggt ggg atg gga ggt atg ggt gga atg gga ggc atg atg taa 1725Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met565 570
〈210〉 3
<211〉 30
<212〉 鹏〈213〉人工序列
<220>
〈221> misc一feature
<222〉 (l).. (30)
<223> 引物
<220>
<221> misc—signal
<222> (4).. (9)
<223> BamH I酶切位点
<400> 3
ccgggatcca tgttacgagc tctaagttca 30
〈210> 4
<211> 28
<212> DNA<213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature
<222> (l)..咖
〈223> 引物
<220>
<221> misc—signal
<222> (4).. (9)
〈223〉 Xhol酶切位点
〈400> 4
gcgctcgagc atcatgcctc ccattcca 28
权利要求
1.一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，其特征在于，所述基因是日本血吸虫热休克蛋白60基因。
2. 根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因序列是编码SEQ ID NO:l所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因序列为SEQ ID N0:2所示核苷酸序列。
4. 根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。
5. —种包含权利要求1所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。
6. —种日本血吸虫热休克蛋白60的制备方法，其特征在于，包括以下歩骤构建含闩本血吸虫热休克蛋白60基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达闩本血吸虫热休克蛋白60;纯化诱导表达的R本血吸虫热休克蛋白60。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60还连接有包含6个组氨酸的标签序列。
8. 权利要求1所述的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。
9. 权利要求1所述的重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。
10. 权利要求6所述制备方法生产的日本血吸虫热休克蛋白60作为预防或治疗血吸虫病疫苗的用途。
全文摘要
本发明公开一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫热休克蛋白60基因。本发明还公开了日本血吸虫热休克蛋白60的制备方法及上述重组表达载体的应用。本发明的含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫热休克蛋白60，该高表达的重组日本血吸虫Hsp60蛋白能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染的保护作用。
文档编号G01N33/53GK101671689SQ20091005767
公开日2010年3月17日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者磊 张, 朱传刚, 林矫矫, 汪勇沛, 珂 陆 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所