专利名称：：寡聚核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一系列寡聚核苷酸的用途，所述的寡聚核苷酸能够用于荧光实时定量PCR法检测微小核酸miR-21的表达，同时也能够应用于制备舌鳞癌诊断和分期及预后评估的试剂，属于生物医学材料
技术领域：
。
背景技术：
：miRNAs的研究分析提示，miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖，甚至'是肿瘤发生。在众多相关疾病中，恶性肿瘤的miRNA表达异常最受瞩目。根据高通量的miRNA微阵列和实时定量RT-PCR(quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)分析，发现在多种人类恶性肿瘤中，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的miRNA表达谱与它们来源的正常组织存在很大区别，这种区别在低分化和恶性程度高的肿瘤组织表现得更显著些。在某些恶性肿瘤中，miRNA含量比来源的正常组织明显降低，肿瘤分化越差，mi脆的含量也越低，如在乳腺癌组织中，miR-10b、let-7、miR-125b和miR-145等的表达明显下调。而某些miRNA在肿瘤组织内的表达却有所上升，如乳腺癌中的miR-155。恶性肿瘤miRNA表达的变化说明肿瘤细胞基因调控机制发生改变，与cDNA微阵列比较，miRNA表达谱能为癌肿的分子分期和分型提供更准确的信息。2002年全球癌症统计数据显示口腔癌占全身恶性肿瘤的2.53%，在所有统计的26种主要恶性肿瘤中排名第八位。国内的统计则为1.45%5.6%不等。舌鳞状细胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma,TSCC,简称舌鳞癌)是最常见的口腔癌，约占口腔恶性肿瘤的43.4%。舌鳞状细胞癌造成患者语言、咀嚼和吞咽等功能障碍，严重影响患者的生存质量。舌鳞癌常常发生早期颈淋巴转移，且转移率较高r近三十年，尽管临床上舌鳞癌的综合治疗已很普遍，但以手术为主，放化疗为辅的综合治疗对舌鳞癌的生存率提高并不明显，5年总体生存率仍然较低，徘徊在30%55%左右，并没有显著'提高，中晚期患者的5年生存率更低，约为27%。而且这些方法都存在各自的局限性，特别是对中晚期和复发4患者疗效不佳，对伴有远处转移者疗效更差。因此，寻找更有效的治疗途径是提高舌鳞状细胞癌生存率和生存质量所亟待解决的难题。而为了提高治疗效果，准确提供舌鳞癌患者治疗的方法，研究与舌鳞癌分期诊断和预后相关的指标，有助于临床医生为患者制定合理的个性化的治疗方案，因此肿瘤标志物的研究一直是广大科学家和临床医生们关注的焦点。
发明内容本发明要解决的技术问题就是提供一种可以作为舌鳞癌诊断、分期和预后评估的标志物。本发明要解决的另一技术问题是提供一系列可用于舌鳞癌诊断、分期和预后评估的标志物检测的寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸可用于制备舌鳞癌诊断、分期和预后评估的试剂。本发明通过大量的实验确定miR-21在不同分化程度、不同时期的舌鳞癌患者中存在差异表达，而且miR-21的不同表达程度与患者的预后和存活时间密切相关。因此。miR-21可以作为舌鳞癌分期诊断和预后评估的标志物。在舌鳞癌中的miR-21具有如下序列TAGCTTATCAGACTGATGTTGA。本发明采用荧光实时定量PCR方法进行舌鳞癌诊断、分期和预后评估的标志物的检测，通过反复实验，筛选得到可以高效、特异检测到待测物的引物和探针。目前，常用的荧光实时定量PCR法主要包括染料法和探针法，探针法又根据所采用探针的不同分为T叫Man探针法和Beacon探针法。对于每一种方法，均需通过反复实验筛选能够特异性检测miR-21的引物和/或探针。染料法miRNA定量分析包括两个步骤茎环结构逆转录引物的逆转录反应和实时荧光定量PCR。茎环结构的逆转录引物睡与miRNA的3'端的部分特异结合，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应。然后特异的正反向引物和荧光染料(常用的染料为SYBRGreenI)共同参与的定量PCR反应体系。SYBRGreenI是一种能结合到双链DNA小沟部位的非特异染料分子，每经过一轮PCR扩增，就会有相应数目的染料分子结合上去，释放出荧光信号被机器所检测到，从而对特定miRNA进行定量检测。对于染料法，本发明优选得到下列引物用于检测第一组RTPrimer:5'-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACAForwardPrimer:5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGATGT-3'ReversePrimer:5，-AATCCATGAGAGATCCCTACCG-3，或第二组-RTPrimer:5'-GTCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGACTCAACAForwardPrimer:5，-GCGGTAGCTTATCAGACTGATGT一3，ReversePrimer:5，-AGTCCTGAGAGATCCGTAGCG-3'。采用T叫Man探针法进行mi脂A定量分析包括两个步骤茎环结构逆转录引物的逆转录反应和实时荧光定量PCR。茎环结构的逆转录引物能与miRNA的3'端的部分结合，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应。然后特异的正反向引物和T叫Man探针共同参与的定量PCR反应体系，对，上述逆转录产物进行定量检测。实时荧光定量PCR反应中，除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针，探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团(供体)和一个淬灭荧光基团(受体)，在反应初始时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，此时检测不到供体荧光信号,而当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模板的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性(也就是切口平移)切割掉探针5'端的报告基团一游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子(报告基团)形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信f进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR中raiRNA的起始拷贝数。对于TaqMan探针法，本发明优选得到下列引物和探针用于检测第一组RTPrimer:5，-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACA-3，Forwardprimer:5'-CCGCCCTAGCTTATCAGAC3，Reverseprimer:5，-TCGCAATCCATGAGAGATC3，Probe:5'-ATGTTGAGTCGCAATCCATGTCG-3，或第二组RTPrimer:5'-GACTCGAGACCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGTCTCGAGTCTCAACA-3'Forwardprimer:5'-CCGCCTAGCTTATCAGACT-3'Reversepri,r:5，-CGAGACCTGAGAGATCCG-3'Probe:5，-TTGAGACTCGAGACCTGTCGC-3，上述探针和引物可以特异性的检测到miR-21。对于其中的探针，5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有对应的荧光淬灭i团。优选的荧光报告基团为FAM,其对应的荧光淬灭基团为DABCYL。分子信标法miRNA定量分析包括两个步骤茎环结构逆转录引物的逆转录反应和实时荧光定量PCR。茎环结构的逆转录引物能与miRNA的3'端的部分特'异结合，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应，然后特异的正反向引物和分子信标探针共同参与的定量PCR反应体系。分子信标(Molecularbeacon,MB)是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。对于Beacon探针法，本发明优选得到下列探针和弓I物用于检测第一组-RTPrimer:5'-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACA-3'ForwardPrimer:5'-GCGTAGCTTATCAGACTG-3'Probe:FAM-5'-CCATTGCCACTCAACATCACAATGG-3'-DABCYLReversePrimer:5'-ATGAGAGATCCCTACCG-3，，或第二组'RTPrimer:5，.-GTCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGACTCAACA-3'7ForwardPrimer:5，-TGCGTAGCTTATCAGACTG—3'Probe:FAM-5'-CACTCGACACTCAACATCACGAGTG-3'-DABCYLReversePrimer:5，-CTGAGAGATCCGTAGCG-3'.上述探针和引物可以特异性的检测到miR-,21。对于其中的探针，5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有对应的荧光淬灭基团。优选的荧光报告基团为FAM，其对应的荧光淬灭基团为MBCYL。qRT-PCR检测验证显示舌鳞癌组织中miR-21的表达高于癌旁组织，中鸣期舌鳞癌组与早期组相比，miR-21的表达倍数改变的差异有统计学意义(代O.001);在不同生存状态组中miR-21表达倍数改变的差异有统计学意义(代0.(KU);在不同分化程度组中miR-21表达倍数改变的差异有统计学意义(代O.05)。上述差异表明，所述的引物和探针可用来制备舌鳞癌诊断、分期和预后评估的试剂。本发明提供的寡聚核苷酸，能够用于研究与舌鳞癌诊断、分期和预后相关的指标，有助于临床医生为患者制定合理的个性化的治疗方案。图1使用染料法第一组寡聚核苷酸进行荧光实时定量PCR检测的曲线图，从左至右分别为癌旁组织和癌组织的扩增曲线图，癌组织中hsa-mir-21的循环数大大小于癌旁组织，因此表达量都高于癌旁组织。图2使用染料法第二组寡聚核苷酸进行荧光实时定量PCR检测的曲线图，从左至右分别为癌旁组织和癌组织的扩增曲线图，癌组织中hsa-mir-2i的循环数大大小于癌旁组织，因此表达量都高于癌旁组织、。图3使用T叫Man探针法第一组寡聚核苷酸进行荧光实时定量PCR检测的曲线图，从左至右分别为癌旁组织和癌组织的扩增曲线图，癌组织中hsaiir-21的循环数大大小于癌旁组织，因此表达量都高于癌旁组织。图4使用TaqMan探针法第二组寡聚核苷酸进行荧光实时定量PCR检测的曲线图，从左至右分别为癌旁组织和癌组织的扩增曲线图，癌组织中hsa-mir-21的循环数大大小于癌旁组织，因此表达量都高于癌旁组织。图5使用Beacon探针法第一组寡聚核苷酸进行荧光实时定量PCR检测的曲线图，从左至右分别为癌旁组织和癌组织的扩增曲线图，癌组织中hsa-mir-21的循环数大大小于癌旁组织，因此表达量都高于癌旁组织。图6使用Beacon探针法第二组寡聚核苷酸进行荧光实时定量PCR检测的曲线图，从左至右分别为癌旁组织和癌组织的扩增曲线，癌组织中hsa-mir-21的循环数大大小于癌旁组织，因此表达量都高于癌旁组织。图750例舌鳞癌組织miR-21表达相对于正常组织的变化倍数柱状图具体实施例方式下面将结合实施例及附图进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例1总固A及miRNA的提取(mirVanamicro認A提取试剂盒，Ambion公司)1加入600ulLysis/BindingSolution,裂解组织；2加入1/10裂解液体积的microRNAHomogenateAdditive,混匀，冰上放置10miri;3加入与裂解液(未加microRNAHomogenateAdditive)等体积的酚氯仿溶液，混匀，最大速度(10，000Xg)室温离心5min;4将上清液移到干净的管子中，弃记下液体的体积；5加入1/3上清液体积的100%酒精，彻底混匀；6将裂解液/酒精的混合物加入到FilterCartridge柱中，10，000Xg离心15s，收集滤液；7FilterCartridge柱上保留的主要为大分子RNA，按照总RNA提取的标准流程回收保留的RNA用于对样品保存质量的判断；8向滤液中加入2/3体积的100%酒精(室温)，混匀；9将混匀的液体加入新的FilterCartridge柱中，10,000rpm离心15s，弃滤液，重复利用收集管；10加入700tilmicroRNAWashSolution1，10,000rpm离心510s,弃滤液，重复利用收集管；11加入500ulWashSolution2、3，10，000rpm离心510s，弃滤液，重复洗涤一次；1210,000Xg空离心1min，以备去除滤膜中残余的液体；13将FilterCartridge柱移到干净的管子中，加入100u1预热到95°CElutionSolution寧Nuclease-freeWater到滤膜中间，最大速度离心2030s，收集滤过液，重复上述步骤一次，合并两次的收集液；14收集的样品用于后面的实验或扭存于-2(TC或更低的温度下。实施例2cDNA的制备(miRNA逆转录)将实施例1抽提得到的miRNA进行逆转录，制备cDNA模板(逆转录引物序列如表l所示)。A:逆转录反应体系:试剂名称(buffer和酶均为pro鹏ga公司)用量/管5XReverseTranscriptionbuffer(缓冲液)'4ulRTPrimerMix(luM)(引物混合液)1.25ul.dNTP(10mM)(四种脱氧核糖核苷酸混合液)0.75ul腿(模板)2ulRTase(200U/ul)(逆转录酶)0.5ulDEPCH20.to20ulB:逆转录反应条件-反应条件为16°C30min;42。C30min;85°ClOmin。实施例3染料法荧光定量PCR检测A:cDNA模板的稀释将实施例2逆转录后得到的cDNA稀释3倍，例如往20ul的体系中加入40u1RNase/DNasefreeddH20,混匀。B:染料萍荧光定量PCR体系-试剂名称用量/管2XReal-timePCRMasterMix,10y1PCRForwardPri鹏r(10uM)0.2u110PCRReversePrimer(10uM)0.2y1DNA/cDNATemplate2u1Taq■polymerase(5U/p1)0.2u1ddH20To20ii1其中，U6所用引物为FPrimer:ATTGGAACGATACAGAGAAGATT;RPrimer:GGAACGCTTCACGAATTTG。miR-21检测所用引物为第一组RTPrimer:5，-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACAForwardPrimer:5，-GCGGTAGCTTATCAGACTGATGT-3'ReversePrimer:5，-AATCCATGAGAGATCCCTACCG-3，第二组RTPrimer:5'-GTCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGACTCAACAForwardPrimer:5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGATGT-3'ReversePrimer:5'-AGTCCTGAGAGATCCGTAGCG-3，。C.反应程序95。C，3min;95。C，15s;62。C,40s，40个循环。其中，2XReal-timePCRMasterMix包括下列组分:组分终浓度体积/管1MTris(pH8.5)10mMa2iii1MHC12.94mM0.0588y11MKC150mMl.Oy11MMgCl22.5raM0.05"1lOmM藩P2000.4p110000XSYBRIX0.002u150XROX0.02X0.008u1ddH20一8.2812jjITotal:10nl实施例4TaqMan法荧光定量PCR检测11A:T叫Man法荧光定量PCR反应体系试剂名称用量/管2XReal-timePCRMasterMix10u1PCRForwardPrimer(10uM)0.4w1PCRReversePrimer(10uM)0.4y1TaqmanProbe(10uM)0.2ii1DNA/c讓Template2u1TaqDNApolymerase(5U/yl)0.2u1ddH20To20y1其中，U6所用引物为Fprimer:ATTGGAACGATACAGAGAAGAT;Rprimer:GGAACGCTTCACGAATTT;探针为FAM-5，-TGGCCCCTGCGCAAGGATG-3，-DABCYL。miR-21所用引物和探针分别为第一组:RTPrimer:5'-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACA-3，F:5，-CCGCCCTAGCTTATCAGAC3，R:5'-TCGCAATCCATGAGAGATC3，Probe:5'-ATGTTGAGTCGCAATCCATGTCG-3'或第二组RTPrimer:5'-GACTCGAGACCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGTCTCGAGTCTCAACA-3'Forwardprimer:5，-CCGCCTAGCTTATCAGACT-3，Reverseprimer:5'-CGAGACCTGAGAGATCCG-3，Probe:5'-TT&AGACTCGAGACCTGTCGC-3'B:反应程序.95°C，3min;9S。C，15s:60。C'lmin，40个循环其中，2XReal-timePCRMasterMix包括下列组分:组分终浓度体积/管1MTris(pH8.5)IQmM0.2ii11MHQ2.94mM0.0588y11MKC150mMl.Ou11MMgCl22.5mM0.05u110mMdNTP200yM0.4ii150XR0X0.02X0.008u1ddH20一8.2814y1Total:10yl实施例5Beacon法荧光定量PCR检测A:Beacon法荧光定量PCR反应体系试剂名称用量/管2XReal-timePCRMasterMix10u1PCRForwardPrimer(10uM)0.4u1PCRReversePrimer(10uM)0.4uiBeaconProbe(10uM〉1.2nl職/c纖Template2u1TaqDNApolymerase(5U/yl)0.2y1ddH20To20li1-其中U6所用引物为Fprimer:CTTCGGCAGCACATATACTAA;Rprimer:GGAACGCTTCACGAATTT;探针为FAM-5'-CCGGGCGATACAGAGAAGATTAGCAGCCC&G-DABCYLmiR21所用引'物和探针分别为第一组RTPrimer:5'-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACA-3'ForwardPrimer:5'-GCGTAGCTTATCAGACTG-3，Probe:FAM-5，-CCATTGCCACTCAACATCACAATGG-3'-DABCYLReversePrimer:5'-ATGAGAGATCCCTACCG—3'或第二组RTPrimer:5'-GTCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGACTCAACA-3'ForwardPrimer:5，—TGCGTAGCTTATCAGACTG-3'Probe:FAM-5'-CACTCGACACTCAACATCACGAGTG-3，-DABCYLReversePrimer:5，-CTGAGAGATCCGTAGCG-3，.B:荧光定量PCR反应条件95°C3min;95°C15s;'60°C，lmin，40个循环其中，2XReal-timePCRMasterMix包括下列组分:组分1MTris(pH8.5)1MHC11MKC11MMgCl210mMdNTP50XROXddH20终浓度lOmM2.94raM50raM2.5函2000.02X体积/管0.2u10.0588u11.On10.05ii10.4u10.008P18.28141Total:10ul实施例6miR-21在舌鳞癌中的表达情况A:miR-21在早期和中晚期舌鳞癌中的表达情况提取正常组织及50例舌鳞癌组织中的RNA，通过实时定量PCR方法检测miR-21在不同组织中的表达情况。图7为50例患者(包括早期舌鳞癌组和中晚期鳞舌鳞癌组)舌鳞癌组织中miR-21的表达相对于对照的癌旁组织中变化的倍数柱状图，可以看出绝大部分舌鳞癌组织中miR-21的表达高于癌旁组织，中晚期舌鳞癌组较癌旁组miR-21的表达增加尤为明显。舌鳞癌ndR-21表达相对于对照组变化的倍数在早期组和中晚期组之间有统计学差异，P<0.001(见表l)。表1舌鳞癌miR-21表达在不同临床分期组间的比较临床分期miR-21表达倍数Nmean土SD尸<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>B:miR-21在不同生存状态组间的比较舌鳞癌miR-21表达在不同生存状况组间的比较存在显著性差异，户<0.001(见表2)。表2舌鳞癌miR-21表达在不同生存状态组间的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>C:miR-21在不同分化程度的癌组织中的表达情况舌鳞癌miR-21表达在不同分化程度组间的比较存在统计学差异，P<0.05(见表3)。表3舌鳞癌miR-21表达在不同分化程度组间的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、下列寡聚核苷酸在检测miR-21表达中的应用第一组RTPrimer5’-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACA-3’ForwardPrimer5’-GCGTAGCTTATCAGACTG-3’Probe5’-CCATTGCCACTCAACATCACAATGG-3’ReversePrimer5’-ATGAGAGATCCCTACCG-3’或第二组RTPrimer5’-GTCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGACTCAACA-3’ForwardPrimer5’-TGCGTAGCTTATCAGACTG-3’Probe5’-CACTCGACACTCAACATCACGAGTG-3’ReversePrimer5’-CTGAGAGATCCGTAGCG-3’。2、下列寡聚核苷酸在检测miR-21表达中的应用第一组RTPrimer:5'-GTCGCAATCCATGAG^GATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACA-3'ForwardPrimer:5'-CCGCCCTAGCTTATCAGAC3'ReversePrimer:5，-TCGCAATCCATGAGAGATC3，Probe:5'-ATGTTGAGTCGCAATCCATGTCG-3'或第二组RTPrimer:5'-GACTCGAGACCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGTCTCGAGTCTCAACA-3'ForwardPrimer:5'-CCGCCTAGCTTATCAGACT-3'ReversePrimer:5'-CGAGACCTGAGAGATCCG-3'Probe:5，-TTGAGACTCGAGACCTGTCGC-3'。3、如权利要求1或2所述的寡聚核苷酸，其特征在于探针的5'端和3'端分别标记荧光报告基团及其对应的荧光淬灭基团。4、如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其特征在于所述的荧光报告基团为FAM，其对应的荧光淬灭基团为DABCYL。5、下列寡聚核苷酸在检测miR-21表达中的应用第一组RTPrimer:5'-GTCGCAATCCATGAGAGATCCCTACCGACATGGATTGCGACTCAACAForwardPrimer:5，-GCGGTAGCTTATCAGACTGATGT-3，ReversePrimer:5，-AATCCATGAGAGATCCCTACCG一3，或第二组RTPrimer:5'-GTCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGACTCAACAForwardPrimer:5，-GCGGTAGCTTATCAGACTGATGT-3'ReversePrimer:5，-AGTCCTGAGAGATCCGTAGCG二3，。6、如权利要求l、2或5所述的寡聚核苷酸在检测miR-21表达中的应用，其特征在于采用荧光实时定量PCR方法进行检测。7、权利要求l、2或5任一项所述的寡聚核苷酸在制备舌鳞癌诊断、分期和预后评估的试剂中的应用。8、用于舌鳞癌诊断、分期和预后评估的试剂盒，其特征在于包括权利要求l、2或5任一项所述的寡聚核苷酸。9、如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于还包括下列组分逆转录酶及其反应缓冲液四种脱氧核糖核苷酸底物DNA'聚合酶荧光定量PCR反应缓冲液人工合成的snRNA—U6的内参及正常人对照品试剂盒使用说明书。全文摘要本发明公开了一系列寡聚核苷酸，在荧光实时定量PCR反应中，采用这些寡聚核苷酸能够特异性地检测miR-21的表达。在此基础上，本发明应用上述寡聚核苷酸制备高表达miR-21的舌鳞癌的诊断、分期和预后评估的试剂。本发明进一步公开了包含上述寡聚核苷酸的试剂盒，该试剂盒可用于舌鳞癌的诊断、分期和预后评估。文档编号C12Q1/68GK101492735SQ20081020439公开日2009年7月29日申请日期2008年12月17日优先权日2008年12月17日发明者宋尔卫,张佩琢,李劲松申请人:苏州吉玛基因药物科技有限公司;李劲松;宋尔卫