专利名称：Jak2基因突变检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是JAK2基因突变检测方法及其试剂盒。
背景技术：
JAK2基因位于人9号染色体短臂，具有25个外显子。JAK2的分子结构与功能已经基本了解。James 等人(Nature. 2005 Apr 28 ；434(7037) :1144-1148.)将 JAK2 基因野生型与V617F突变型体外转染细胞株实验发现，野生型能够激活STAT介导的转录过程，而 V617F突变型无此功能。他们又进一步将转染有野生型JAK2基因和V617F突变型的细胞移植至小鼠，发现移植了 V617F突变性骨髓的小鼠能够引起血细胞异常增多。这些体内和体外实验均表明，JAK2基因V617F突变能够导致MPN的发生。JAK2突变主要发生位点在 14号外显子的V617F。(申请号/专利号200580042022)。但是，在14号外显子上除常见的V617F突变以外，还存在其它如K607N，L611V等多种类型突变(Oncogene. 2006Mar 2 ； 25(9) :1434-6. Leukemia. 2010 May ；24(5) :1069-73.)。JAK2 基因 12 号外显子突变没有突变热点，目前发现JAK2基因12号外显子突变类型及位点至少有十种以上(Blood. February 1,2008 vol.1ll no. 3 1686-1689)。以往对JAK2的突变检测仅仅针对一种突变类型或者一个突变位点(申请号/专利号200910051739 ;申请号/专利号200780021194 ;申请号/ 专利号200880006541)，因此应用基因测序(Sequence-Based Testing, SBT)技术对 JAK2 基因12、14号外显子序列进行测序，必将成为检测JAK2基因突变的发展方向。
JAK2 突变对骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN)的分类和诊断具有划时代的意义。2008年，世界卫生组织(WHO)将骨髓增殖性疾病 (myeloproliferativedisorder,MPD)改名为MPN,主要包括以下9种类型,①.慢性粒细胞白血病(CML)②.真性红细胞增多症(PV)③.原发性血小板增多症(ET)④.慢性原发性骨髓纤维化(MF)⑤.慢性中性粒细胞白血病(CNL)⑥.慢性嗜酸细胞性白血病(CEL)⑦· 高嗜酸细胞综合症(HES)⑧.肥大细胞病(MCD)⑨.不能分类的骨髓增 殖性肿瘤(MPN-U)。 2008年，随着对MPD的肿瘤本质得到确认，WHO将MPD改名为MPN。MPN疾病的单病种发病率大多在1/10万以下，属于罕见疾病。近10年来，随着人们生活水平的提高及医疗条件的改善，已发现的MPN患者总数增加了三倍左右。JAK2基因在PV、ET、IMF中具有较高的突变几率。其中，PV患者JAK2突变率达到90%以上，ET、MF患者JAK2突变率有50%以上。 JAK2突变在其它MPN疾病中也存在一定的突变机率。除在体检中发现外周血异常而跟踪复查并确诊的患者外，本病的漏诊、误诊率很高。因此，JAK2基因是否存在突变对患者的诊断具有重要的意义。
目前，国内只有针对某一位点如V617F突变PCR检测，以及应用探针检测的方法。 这些方法在实际应用中存在检测范围小的局限性，而且，从临床角度来讲，还存在一定的漏检率。发明内容
本发明正是针对以上技术问题，提供一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的JAK2基因突变检测方法及其试剂盒，除可对患者外周血检测外，也可对添加肝素的患者骨髓标本进行检测。
本发明通过以下技术方案来实现
本发明提供一种JAK2基因突变检测方法，包括以下步骤
(a)提取待检样本的DNA ；
(b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增；
(C)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序；
(d)将步骤(C)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、 反两个方向进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。
本发明根据人9号染色体基因组序列登录号NT_008413. 18设计JAK2基因12号和14号相关引物如下，
JAK2基因12号外显子PCR扩增引物
JAK2E12F 5/ -CAATGAGTTGACCCCTAA -3' (NT_008413. 18 :5059763-5059780)；
JAK2E12R 5/ -GCTAACATCTAACACAAGG-3' (ΝΤ_008413· 18 :5060201-5060219)，
JAK2基因12号外显子测序反应引物
JAK2E12F2 5/ -TAGGAGTTATTAAGCATT-3' (NT_008413. 18 :5059811-5059828)；
JAK2E12R2 5/ -AATTCCAATGTCACATGA-3' (ΝΤ_008413· 18 :5060123-5060140)，
JAK2基因14号外显子PCR扩增引物
JAK2E14F 5/ -GCATCTTTATTATGGCAGAG-3' (NT_008413. 18 :5063611-5063630)；
JAK2E14R 5/ -TGGGCATTGTAACCTTCTAC-3' (ΝΤ_008413· 18 :5063981-5064000)，
JAK2基因14号外显子测序反应引物
JAK2E14F2 5 ' -TTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGC-3 ' (ΝΤ_008413· 18 5063690-5063711)；
JAK2E14R2 5 ' -GTTTACACTGACACCTAGCTG-3 ' (ΝΤ_008413· 18 5063866-5063886)。
本发明提供JAK2基因突变检测试剂盒，包括PCR Amplification Mixture ； Primer (12 号外显子、14 号外显子)、HotStarTaq 酶、消化酶、Sequencing Mixture (正向、 反向)
本发明JAK2基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为每50μ1中含5μ1的10倍扩增缓冲液、2111浓度为25禮的1%2+、 2μ I浓度为IOmM的dNTPs、1.5y I浓度为10 μ M的正向引物、1. 5 μ I浓度为10 μ M的反向引物、O. 3μ I的Taq DNA聚合酶、I μ I的DNA模板、余量为HiH2O，测序反应体系为4μ I的 BigdyeV3. 1、3μ I 的 πιΗ20、1μ I 浓度为 10 μ M 的 Sequencing 引物(F，R)、2y I 的 PCR 产物。
本发明JAK2基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为先95°C反应15min，然后94°C反应O. 5min，然后56°C反应O. 5min，然后72°C反应Imin为一个循环，共反应35个循环然后72 C反应7min,最后4 C保存。
本发明JAK2基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为先94°C反应O. 5min，然后50°C反应O. 5min，然后60V反应2. Omin为一个循环，共反应24个循环。
具体实施方式
下面以一例典型真性红细胞增多症患者的待检样本为例对本发明做进一步说明。
(a)提取待检样本的DNA ；
(b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增；
(c)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序；
(d)将步骤(C)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、反两个方向进行比较，经过序列分析发现是在JAK2基因12号外显子(基因登陆号 NM_004972)第 2133bp 插入了 ATGTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATA，共 33 个碱基，经过位点确认是在第546位与547位AA之间插入了 11个AA，其中第一个AA为起始密码子甲 硫氨酸(Met，M)，第2 11个AA为JAK2基因12号外显子第537 546位AA。这种突变与已经发现的V536-1546dupll (即重复第536 54611个AA)以及F537 I546dupl0 (即重复第 537 54610 个 AA)突变类型均不相同。(BL00D. 2008111 :1686-1689. do1:10. 1182/ blood-2007-07-101576)。在国际国内上属首次报道。
权利要求
1.本发明提供JAK2基因突变检测方法，包括以下步骤 (a)提取待检样本的DNA； (b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增； (c)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序； (d)将步骤(c)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、反两个方向进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。
2.本发明根据人9号染色体基因组序列登录号NT_008413.18设计JAK2基因12号和14号相关引物如下， JAK2基因12号外显子PCR扩增引物JAK2E12F :5' -CAATGAGTTGACCCCTAA-3' (NT_008413. 18 :5059763-5059780)；JAK2E12R :5' -GCTAACATCTAACACAAGG-3' (NT_008413. 18 :5060201-5060219)， JAK2基因12号外显子测序反应引物JAK2E12F2 :5' -TAGGAGTTATTAAGCATT-3' (NT_008413. 18 :5059811-5059828)；JAK2E12R2 :5' -AATTCCAATGTCACATGA-3' (NT_008413. 18 :5060123-5060140), JAK2基因14号外显子PCR扩增引物JAK2E14F :5' -GCATCTTTATTATGGCAGAG-3' (NT_008413. 18 :5063611-5063630)；JAK2E14R :5' -TGGGCATTGTAACCTTCTAC-3' (NT_008413. 18 :5063981-5064000)， JAK2基因14号外显子测序反应引物JAK2E14F2 :5' -TTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGC-3' (NT_008413. 18 :5063690-5063711)；JAK2E14R2 :5' -GTTTACACTGACACCTAGCTG-3' (NT_008413. 18 :5063866-5063886)。
3.本发明提供JAK2基因突变检测试剂盒，包括PCRAmplification Mixture ；Primer (12 号外显子、14 号外显子)、HotStarTaq 酶、消化酶、Sequencing Mixture (正向、反向)。
4.根据权利要求3所述JAK2基因突变检测试剂盒，其特征在于JAK2基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为每50^1中含5iU的10倍扩增缓冲液、2 ii I浓度为25mM的Mg2+、2 y I浓度为IOmM的dNTPs、1. 5 U I浓度为IOiiM的正向引物、1.1浓度为IOiiM的反向引物、0. 3iil的Taq DNA聚合酶、Iii I的DNA模板、余量为mH20,测序反应体系为4ii I的BigdyeV3. 1>3 U I的mH20、l y I浓度为10 y M的 Sequencing 引物(F，R)、2yl 的 PCR 产物。
5.根据权利要求3所述JAK2基因突变检测试剂盒，其特征在于JAK2基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为先95°C反应15min，然后94°C反应0. 5min，然后56°C反应0.5min,然后72°C反应Imin为一个循环，共反应35个循环然后72°C反应7min，最后4°C保存。
6.根据权利要求3所述JAK2基因突变检测试剂盒，其特征在于JAK2基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为先94°C反应0. 5min，然后50°C反应0. 5min，然后60°C反应2.Omin为一个循环，共反应24个循环。
全文摘要
JAK2突变对骨髓增殖性肿瘤的分类和诊断具有划时代的意义，本发明针对现有技术中对JAK2突变存在检测范围小的局限，以及存在一定的漏检率的问题，提供一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的JAK2基因突变检测方法及其试剂盒，除可对患者外周血检测外，也可对添加肝素的患者骨髓标本进行检测。
文档编号C12N15/11GK102994613SQ20111026656
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者费敏, 沈宏杰 申请人:苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司