专利名称：无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量pcr方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域中DNA检测方法，尤其涉及一种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，用于短片段DNA检测。
背景技术：
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产。这些转基因作物在被加工成食品、饲料的同时也产生了大量的深加工转基因产品和加工废弃物。
由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。这就使对于转基因深加工产品和加工废弃物中小片段转基因成分的检测方法的研究显得格外重要。目前，已有许多研究者致力于对深加工产品成分鉴定=Breton等通过简单重复序列的扩增片段多态性、Pafundo等则通过扩增片段长度多态性，检测食用油中的橄榄油成分(Breton等，2004 ;Pafundo等，2005) ；Bai等通过将PCR与芯片杂交技术相结合，快速鉴定植物油中的花生、棉花、油棕、芝麻、玉米、向日葵成分(Bai 等,2011) ；Zhou等利用磁珠法富集DNA片段，然后通过突光关联光谱法(Fluorescence cross-correlation spectroscopy),利用P-35S兀件对样品进行转基因筛查(Zhou等， 2009)。以上方法都是基于DNA降解程度不严重，能成功回收，且有足够的长片段作为模板。 但是由于深加工产品自身的特性，DNA的提取回收困难，且回收到的均为弥散小片段，对小片段核苷酸分子的快速检测仍为一大难题。
我们希望通过对于小片段转基因成分的检测方法的研究探索，进而监测转基因深加工产品和原料加工过程中产生的废弃物中转基因成分，规范我国转基因食品市场和加工企业废弃物的排放标准，进一步完善我国转基因安全管理体系，保障我国转基因产业的健康发展。发明内容
本发明的目的就在于克服现有转基因检测技术对于短片段DNA的检测存在的困难，提供一种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法。
本发明的目的是这样实现的根据需要检测的DNA靶标序列设计出扩增片段长度在35-45bp、特异性强、灵敏度高的引物组合，分别在其上下游引物接近3’端标记荧光基团和淬灭基团，在定量PCR扩增过程中，荧光信号会随着扩增的进行逐渐降低。
适用于短片段DNA成分的检测，解决了原有TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物I条探针从而使最短检测靶标很难低于70bp，以及染料法在PCR产物过短情况下很难区分PCR产物和引物二聚体的问题。
一、方法本方 法包括下列步骤①收集序列收集水稻、玉米、油菜和大豆等转基因作物内标准基因以及外源基因的序列；②利用上述序列特征设计引物利用上述水稻、玉米、油菜和大豆等转基因作物内标准基因以及外源基因的序列分别设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合；并在上游引物靠近3’端的胸腺卩密唳碱基处标记突光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；③PCR扩增以含有内标准基因和外源基因的转基因作物为研究模板，分别利用上述引物组合进行荧光定量PCR扩增；转基因作物基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。 并在延伸步骤后记录荧光信号强度的变化，随着PCR产物的积累，荧光信号会逐渐降低至设定的阈值。
工作机理普通Taqman荧光定量PCR需要一对引物以及一条5 ’端标记荧光基团，3 ’端标记淬灭基团的探针，这样就导致其最短检测靶标长度超过70bp，而本方法则是只需要二条分别标记了荧光集团和淬灭基团的引物，这样其检测靶标长度其实可以达到35-45bp，也就是差不多两条引物的长度，二者的区别在于本方法在PCR反应的过程中荧光基团和淬灭基团是先分开的，然后随着反应的进行而结合在一起，所以其荧光信号随着反应的进行呈下降的趋势并且逐渐降低至设定的阈值，而普通Taqman荧光定量PCR的荧光信号值随着反应的进行是呈上升趋势的。
二、应用 本方法可应用于短片段DNA成分的检测。
已经实验验证的可适用于本方法进行定量检测的基因包括下列6种水稻内标准基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜内标准基因CruA、玉米内标准基因 hmga、大豆内标准基因Lectin和大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS0
已经试验验证的可适用于本方法进行检测的转基因作物包括下列17种转基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻、转基因油菜0XY235、转基因油菜RT73、转基因油菜RF3、转基因油菜RF2、转基因油菜MS8、转基因油菜MS1、转基因油菜Topas 19/2、转基因玉米MIR604、转基因玉米MIRl62、转基因玉米59122、转基因大 Μοη89788、转基因大豆Α2704-12、转基因大豆Α5547-127和转基因大豆GTS40-3-2。
与现有短片段DNA检测方法相比，本发明具有下列优点和积极效果1、避免了TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物I条探针从而使最短检测靶标很难达到35_45bp的问题；2、避免了染料法荧光定量PCR在产物过短情况下很难区分PCR产物和引物二聚体的问题。
3、适用于转基因水稻、油菜、大豆和玉米等作物中短片段DNA的检测。
图1是基于本方法设计的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD 的序列中的位置图；图2是基于本方法设计的引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1 转化事件所含CrylAc基因的序列中的位置图；图3是基于本方法设计的引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜内标准基因 CruA的序列中的位置图；图4是基于本方法设计的引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T在玉米内标准基因hmga 的序列中的位置图；图5是基于本方法设计的引物组合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆内标准基因Lectin 的序列中的位置图；图6是基于本方法设计的引物组合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修饰过的 CP4 EPSPS的序列中的位置图；图7是基于本方法的水稻内标准基因PLD加空白对照定量扩增曲线图；图8是基于本方法的水稻外源基因TT51加空白对照定量扩增曲线图；图9是基于本方法的油菜内标准基因CruA加空白对照定量扩增曲线图；图10是基于本方法的玉米内标准基因hmga加空白对照定量扩增曲线图；图11是基于本方法的大豆内标准基因Lectin加空白对照定量扩增曲线图；图12是基于本方法的大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS加空白对照定量扩增曲线图； 图13是基于本方法的水稻内标准基因PLD灵敏度实验定量扩增曲线图；图14是基于本方法的水稻外源基因TT51灵敏度实验定量扩增曲线图；图15是基于本方法的油菜内标准基因CruA灵敏度实验定量扩增曲线图；图16是基于本方法的玉米内标准基因hmga灵敏度实验定量扩增曲线图；图17是基于本方法的大豆内标准基因Lectin灵敏度实验定量扩增曲线图；图18是基于本方法的大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS灵敏度实验定量扩增曲线图； 图19是基于本方法检测转基因水稻TT51-1中内标准基因PLD定量扩增曲线图；图20是基于本方法检测转基因水稻科丰6号中内标准基因PLD定量扩增曲线图；图21是基于本方法检测转基因水稻克螟稻中内标准基因PLD定量扩增曲线图；图22是基于本方法检测转基因水稻TT51-1中外源基因TT51定量扩增曲线图；图23是基于本方法检测转基因水稻科丰6号中外源基因TT51定量扩增曲线图；图24是基于本方法检测转 基因水稻克螟稻中外源基因TT51定量扩增曲线图；图25是基于本方法检测转基因油菜0XY235中内标准基因CruA定量扩增曲线图；图26是基于本方法检测转基因油菜RT73中内标准基因CruA定量扩增曲线图；图27是基于本方法检测转基因油菜RF3中内标准基因CruA定量扩增曲线28是基于本方法检测转基因油菜RF2中内标准基因CruA定量扩增曲线29是基于本方法检测转基因油菜MS8中内标准基因CruA定量扩增曲线30是基于本方法检测转基因油菜MSl中内标准基因CruA定量扩增曲线31是基于本方法检测转基因油菜Topasl9/2中内标准基因CruA定量扩增曲线32是基于本方法检测转基因玉米MIR604中内标准基因hmga定量扩增曲线图；图33是基于本方法检测转基因玉米MIR162中内标准基因hmga定量扩增曲线图；图34是基于本方法检测转基因玉米59122中内标准基因hmga定量扩增曲线图；图35是基于本方法检测转基因大豆Mon89788中内标准基因Lectin定量扩增曲线图； 图36是基于本方法检测转基因大豆A2704-12中内标准基因Lectin定量扩增曲线图； 图37是基于本方法检测转基因大豆A5547-127中内标准基因Lectin定量扩增曲线图；图38是基于本方法检测转基因大豆GTS40-3-2中内标准基因Lectin定量扩增曲线图；图39是基于本方法检测转基因大豆Mon89788中外源基因修饰过的CP4 EPSPS定量扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明详细说明一、本方法分别对下列四种进行1、以转基因水稻品种TT51-1为例进行本方法包括下列步骤①收集序列收集水稻内标准基因PLD和转基因水稻TT51-1转化事件所含CrylAc基因的序列；②利用上述序列特征设计引物设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T ；引物序列分别为PLDF2714F gctgggaggacgtgtTcg,PLDR2755T ggtgcttggcgttgcTga,BtTT51F1140F aacagagttcgcctaTgga,BtTT51R1180T cggatggcaagtTagaagagg ；并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团 6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物 PLDR2755T 和 BtTT51R1180T 靠近 3’ 端的胸腺喃唳喊基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；该引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD序列中的位置如图1所示； 引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1转化事件所含CrylAc基因的序列中的位置如图2所示；③PCR扩增以含有水稻内标准基因PLD和水稻外源TT51-1转化事件的转基因水稻TT51-1为研究模板，分别利用上述引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51`F1140F/BtTT51R1180T进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR 反应。
2、以转基因油菜品种0XY235为例进行本方法包括下列步骤①收集序列收集油菜内标准基因CruA的序列；②利用上述序列特征设计引物设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T ；引物序列分别为BnCruAF1635F :gatgacccatctaatgcTgacg，BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa，并在上述引物BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团 6-carboxy-fluorescein (FAM),对应下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺卩密唳碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；该引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜内标准基因CruA序列中的位置如图 3所示；③PCR扩增以含有油菜内标准基因CruA的转基因油菜0XY235为研究模板，分别利用上述引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T进行荧光定量PCR扩增；转基因油菜0XY235基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。
3、以转基因玉米品种MIR604为例进行本方法包括下列步骤①收集序列收集玉米内标准基因hmga的序列；②利用上述序列特征设计引物设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T ；引物序列分别为ZmHMGFlOlF :cgtggcgtccgaagcaTt，ZmHMGRI44T :ggcggatgtcataaTaacagaaa，并在上述引物ZmHMGFlOlF靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团 6-carboxy-fluorescein (FAM),对应下游引物ZmHMGR144T靠近3’端的胸腺喃唳碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；该引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T在玉米内标准基因hmga序列中的位置如图4所示；③PCR扩增以含有玉米内标准基因hmga的转基因玉米MIR604为研究模板，分别利用上述引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T进行荧光定量PCR扩增；转基因玉米MIR 604基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。
4、以转基因大 品种Mon89788为例进打本方法包括下列步骤①收集序列收集大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列；②利用上述序列特征设计引物设计扩增片段长度在35_45bp的引物组合GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T ；引物序列分别为GmLeF530F ctatcagatccaTcaaaacgacg,GmLeR568T tggccaaaTcccaagacg,MoCEF732F tccatcctctactgcttTccc,MoCER770T agcaaggcagcaaccaaTg ；并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团 6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物 GmLeR568T 和 MoCER770T 靠近 3’ 端的胸腺 U密P定喊基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；该引物组合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆内标准基因Lectin序列中的位置如图5所示；引物组合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS序列中的位置如图6所示；③PCR扩增以含有大大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的转基因大豆 Mon89788为研究模板，分别利用上述引物组合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/ MoCER770T进行荧光定量PCR扩增；转基因大豆Mon89788基因组DNA被水稀释至不同含量， 进行荧光定量PCR反应。
二、具体方法1、准备工作利用SDS法提取转基因作物DNA模板先将 20% SDS 预热至Ij 65。C，取 15 ml SDS 抽提 buffer (O.1TrisHCl, O. 05M EDTA, IM NaCl pH8. O)加入到50ml离心管，再加入2. 5 μ β -巯基乙醇，混匀；液氮研磨3g左右的转基因水稻TT51-1叶片、转基因水稻科丰6号叶片、转基因水稻克螟稻叶片、转基因油菜 0XY235叶片，转基因油菜RT73叶片、转基因油菜RF3叶片、转基因油菜RF2叶片、转基因油菜MS8叶片、转基因油菜MSl叶片、转基因油菜Topasl9/2叶片、转基因玉米MIR604种子、 转基因玉米MIR162种子、转基因玉米59122种子、转基因大豆Mon89788种子、转基因大豆 A2704-12种子、转基因大豆A5547-127种子、转基因大豆GTS40-3-2种子,将粉末转至50ml 含抽提buffer的50 ml离心管中，在振荡器上振荡混匀，加入2 ml预热的20%SDS，混匀， 65° C水浴至少30分钟，其间要轻轻摇动试管；水浴后，迅速将离心管置于冰上，加入3ml 3M KAc，混匀，在冰上放置30分钟；4 ° C 5000g离心5min ;将上清转移到新的50 ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20° C放置30min以上；6000g，4° C离心15min， 倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超纯水溶解DNA，溶解后，将溶液转移到15ml的离心管中；按DNA溶解体积的1%加蛋白酶K，55° C水浴30min ;加入等体积苯酚，混匀，轻摇30min,8000g离心IOmin ;转移上清至新的tube中，加等体积的苯酹-氯仿-异戍醇(25 24 :1),轻摇20min,8000g离心15min ;转移上清至新的tube中，加等体积的氯仿-异戍醇 (24 :1)，轻摇20min，8000g离心15min ;吸取上清，每管加入5μ1 RNase,混匀，37。C水浴 Ihr降解RNA ;用等体积的苯酹抽提一次,轻摇20min，8000g离心15 min ;转移上清至新的离心管中，加等体积的氯仿-异戍醇(24:1)，轻摇20min,8000g离心15min ;吸上清加入 1/10体积3M NaAC，混匀，加入等体积异丙醇，-20° C放置30min，沉淀DNA ;6000g，4° C 离心15min，倒掉上清，用75%乙醇洗2遍，离心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超纯水溶解DNA备用。
2、具体操作①以水稻内标准基因PLD和水稻TT51-1转化事件外源基因CrylAc的序列设计扩增片段长度在35-45bp的荧光标记引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/ BtTT51R1180To 引物序列分别为PLDF2714F: gctgggaggacgtgtTcg, PLDR2755T: ggtgcttggcgttgcTga 以及 TT51F1140F: aacagagttcgcctaTgga, BtTT51Rl180T: cggatggcaagtTagaagagg。并在上述引物 PLDF2714F 和 TT51F1140F 靠近 3’ 端的胸腺U密唳喊基处标记突光基团 the fluorescent re·porter 6-carboxy-fluorescein (FAM), 对应下游引物PLDR2755T和BtTT51R1180T靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
转基因水稻TT51-1转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/^l。
PCR反应体积25μ1，含模板DNA μ ，其他组分含量为lx TaqMan Universal Master,引物 PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T 各 400μΜ。
TaqMan反应条件为95° C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环95° C 15秒变性，60° C I分钟退火及延伸，收集荧光信号。
分别以 PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T 为引物，以上述浓度为20ng/^l的转基因水稻TT51-1转化事件为模板稀释至lOng/μΙ进行荧光定量PCR 扩增，并且做空白对照试验，扩增曲线如图7、8所示。所有的荧光定量反应都重复4次。
用水将转基因水稻TT51-1基因组DNA稀释至不同浓度，以 μ 基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，0.8，0.16，0.0321^转基因水稻 ΤΤ51-1转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4 次。
②以油菜内标准基因CruA的序列设计扩增片段长度在35_45bp的荧光标记引物组合 BnCruAF1635F/BnCruAR1679T0 引物序列分别为BnCruAF1635F gatgacccatctaatgcTgacg, BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa。并在上述引物 BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺卩密唳喊基处标记突光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
转基因油菜0XY235转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/^l。
PCR反应体积25μ1，含模板DNA μ ，其他组分含量为lx TaqMan Universal Master,弓丨物 BnCruAF1635F/BnCruAR1679T 各 400μΜ。
TaqMan反应条件为95° C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环95° C 15秒变性，60° C I分钟退火及延伸，收集荧光信号。
以BnCruAF1635F/BnCruAR1679T为引物，以上述浓度为20ng/^l的转基因油菜0XY235转化事件为模板稀释至lOng/μΙ进行荧光定量PCR扩增，并且做空白对照试验， 扩增曲线如图9所示。所有的荧光定量反应都重复4次。
用水将转基因油菜0XY235基因组DNA稀释至不同浓度，以 μ 基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，O. 8，O. 16，O. 032ng转基因油菜 0XY235转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4 次。
③以玉米内标准基因hmga的序列设计扩增片段长度在35_45bp的荧光标记引物组合 ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T。引物序列分别为ZmHMGF101F cgtggcgtccgaagcaTt, ZmHMGR144T :ggcggatgtcataaTaacagaaa。并在上述引物 ZmHMGFlOlF 靠近 3’ 端的胸腺卩密唳碱基处标记突光基团6-carboxy-fluorescein (FAM),对应下游引物ZmHMGR144T靠近3’端的胸腺卩密唳喊基处标记淬灭基团tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
转基因玉米MIR604转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/^l。
PCR反应体积25μ1，含模板DNA μ ，其他组分含量为lx TaqMan Universal Master,引物 ZmHMGFlO lF/ZmHMGR144T 各 400μΜ。
TaqMan反应条件为95° C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环95° C 15秒变性，60° C I分钟退火及延伸，收集荧光信号。
以ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T为引物，以上述浓度为20ng/^l的转基因玉米MIR604 转化事件为模板稀释至lOng/μΙ进行荧光定量PCR扩增，并且做空白对照试验，扩增曲线如图10所示。所有的突光定量反应都重复4次。
用水将转基因玉米MIR604基因组DNA稀释至不同浓度，以 μ 基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，O. 8，O. 16，O. 032ng转基因玉米 MIR604转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4 次。
④以大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列设计扩增片段长度在35-45bp的荧光标记引物组合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T。弓丨物序列分别为GmLeF530F ctatcagatccaTcaaaacgacg, GmLeR568 T tggccaaaTcccaagacg 以及 MoCEF732F tccatcctctactgcttTccc, MoCER770T :agcaaggcagcaaccaaTg。 并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团 6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物 GmLeR568T 和 MoCER770T 靠近 3’ 端的胸腺U密P定喊基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
转基因大豆Mon89788转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/^l。
PCR反应体积25μ1，含模板DNA μ ，其他组分含量为lx TaqMan Universal Master,弓丨物 GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T 各 400μΜ。
TaqMan反应条件为95° C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环95° C 15秒变性，60° C I分钟退火及延伸，收集荧光信号。
分别以GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T 为引物，以上述浓度为 20ηδ/μ1的转基因大豆Μοη89788转化事件为模板稀释至lOng/μΙ进行荧光定量PCR扩增， 并且做空白对照试验，扩增曲线如图11、12所示。所有的荧光定量反应都重复4次。
用水将转基因大豆Μοη89788基因组DNA稀释至不同浓度，以 μ 基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，O. 8，O. 16，O. 032ng转基因大豆 Mon89788转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4 次。
二、应用上述，可适用于本方法进行定量检测的基因包括水稻内标准基因PLD、水稻外源基因 TT51、油菜内标准基因CruA、玉米内标准基因hmga、大豆内标准基因Lectin、大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS0已经试验验证的可适用于本方法进行检测的转基因作物包括基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻、转基因油菜0XY235，转基因油菜RT73、 转基因油菜RF3、转基因油菜RF2、转基因油菜MS8、转基因油菜MS1、转基因油菜Topas 19/2、 转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米59122、转基因大豆Mon89788、转基因大豆A2704-12、转基因大豆A5547-127、转基因大豆GTS40-3-2。
针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法分别设计针对于水稻内标准基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜内标准基因CruA、玉米内标准基因hmga、大豆内标准基因Lectin、大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T、 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T、BnCruAF1635F/BnCruAR1679T、ZmHMGFlOlF/ZmHMG R144T、 GmLeF530F/GmLeR568T、MoCEF732F/MoCER770T,如下表所示
权利要求
1.一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移 定量PCR方法，其特征在于 所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆； ①收集序列 收集转基因作物内标准基因以及外源基因的序列； ②利用上述序列特征设计引物 利用上述转基因作物内标准基因以及外源基因的序列分别设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合； 并在上游引物靠近3’端的胸腺卩密唳碱基处标记突光基团6-carboxy-fluorescein(FAM)，对应下游引物靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； ③PCR扩增 以含有内标准基因和外源基因的转基因作物为研究模板，分别利用上述引物组合进行荧光定量PCR扩增；转基因作物基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应，并在延伸步骤后记录荧光信号强度的变化，随着PCR产物的积累，荧光信号会逐渐降低至设定的阈值。
2.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因水稻检测的定量PCR方法 ①收集序列 收集水稻内标准基因PLD和转基因水稻TT51-1转化事件所含CrylAc基因的序列； ②利用上述序列特征设计引物 设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T ； 引物序列分别为PLDF2714F gctgggaggacgtgtTcg,PLDR2755T ggtgcttggcgttgcTga,BtTT51F1140F aacagagttcgcctaTgga,BtTT51R1180T cggatggcaagtTagaagagg ； 并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物 PLDR2755T 和 BtIT51R1180T 靠近 3’ 端的胸腺喃唳喊基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 该引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD序列中的位置如图1所示；引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1转化事件所含CrylAc基因的序列中的位置如图2所示； ③PCR扩增 以含有水稻内标准基因PLD和水稻外源TT51-1转化事件的转基因水稻TT51-1为研究模板，分别利用上述引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtIT51F1140F/BtTT51R1180T进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。
3.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因油菜检测的定量PCR方法 ①收集序列 收集油菜内标准基因CruA的序列； ②利用上述序列特征设计引物 设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T ； 引物序列分别为BnCruAF1635F :gatgacccatctaatgcTgacg，BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa， 并在上述引物BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-f luorescein (FAM),对应下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺卩密唳碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 该引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜内标准基因CruA序列中的位置如图3所示； ③PCR扩增 以含有油菜内标准基因CruA的转基因油菜0XY235为研究模板，分别利用上述引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T进行荧光定量PCR扩增；转基因油菜0XY235基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。
4.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因玉米检 测的定量PCR方法 ①收集序列 收集玉米内标准基因hmga的序列； ②利用上述序列特征设计引物 设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T ； 引物序列分别为ZmHMGFlOlF :cgtggcgtccgaagcaTt，ZmHMGR144T :ggcggatgtcataaTaacagaaa， 并在上述引物ZmHMGFlOlF靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-f luorescein (FAM),对应下游引物ZmHMGR144T靠近3’端的胸腺卩密唳碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 该引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T在玉米内标准基因hmga序列中的位置如图4所示； ③PCR扩增 以含有玉米内标准基因hmga的转基因玉米MIR604为研究模板，分别利用上述引物组合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T进行荧光定量PCR扩增；转基因玉米MIR604基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。
5.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因大豆检测的定量PCR方法 ①收集序列 收集大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列； ②利用上述序列特征设计引物 设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T ； 引物序列分别为GmLeF530F :ctatcagatccaTcaaaacgacg，GmLeR568T :tggccaaaTcccaagacg，MoCEF732F :tccatcctctactgcttTccc，MoCER770T agcaaggcagcaaccaaTg ； 并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物 GmLeR568T 和 MoCER770T 靠近 3’ 端的胸腺U密P定喊基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 该引物组合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆内标准基因Lectin序列中的位置如图5所示；引物组合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS序列中的位置如图6所示； ③PCR扩增 以含有大大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的转基因大豆Mon89788为研究模板，分别利用上述引物组合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T进行荧光定量PCR扩增；转基因大豆Mon89788基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，涉及生物工程技术领域中DNA检测方法。所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆；所述的方法是①收集序列；②利用上述序列特征设计引物；③PCR扩增。本发明避免了TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物1条探针从而使最短检测靶标很难达到35-45bp的问题；避免了染料法荧光定量PCR在产物过短情况下很难区分PCR产物和引物二聚体的问题；适用于转基因水稻、油菜、大豆和玉米作物中短片段DNA的检测。
文档编号C12Q1/68GK103045733SQ201210551429
公开日2013年4月17日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者吴刚, 李伟, 李晓飞 申请人:中国农业科学院油料作物研究所