新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物及其pcr鉴别方法
【专利摘要】一种新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物及其PCR鉴别方法，上游引物：5'-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3'；下游引物：5'-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3'。采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭基因组DNA；反应体系：PCR反应体系为25μL，成分为上、下游引物、10×Buffer、dNTP、rTaqDNA聚合酶，进行PCR扩增；在琼脂糖凝胶上将PCR扩增产物进行电泳，通过电泳图谱判断梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭真伪。该鉴别方法分辨力强、重现性好，保障群众用药安全，弥补传统中药鉴定中动物类中药鉴别的弱项，为临床合理用药提供科学依据。
【专利说明】新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物及其PCR鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物及其PCR鉴别方法。
技术背景
[0002]鹿鞭又名鹿肾，鹿冲，主要治疗阳痿、肾虚耳鸣、妇人子宫寒冷、久不受孕、慢性睾丸发炎等疾病。梅花鹿鹿鞭药用价值高但市场价格昂贵，新西兰赤鹿鹿鞭与梅花鹿鹿鞭外观和形状相似而且价格低廉，但新西兰赤鹿鹿鞭的药用价值远远不及梅花鹿鹿鞭，由于梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭通过肉眼很难分辨，市场上一些不法商家为谋取更高的经济利益，以新西兰赤鹿鹿鞭冒充梅花鹿鹿鞭进行销售，严重影响了鹿鞭的药效，并且造成患者健康受损以及经济损失。由于中成药的组成及成分复杂，干扰因素多，用传统生药学方法鉴定其真伪及纯度有较大的难度，因此，目前还没有一种比较快速灵敏、准确可靠、分辨力强、重现性好的新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别方法。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种快速灵敏、准确可靠、分辨力强、重现性好的新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物及其PCR鉴别方法。
[0004]本发明的技术解决方案是:
一种新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物，引物序列为:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0005]一种新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鉴别方法，其具体步骤如下:
1.1、新西兰赤鹿鹿鞭与梅花鹿鹿鞭的基因组DNA提取方法
将新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分别用酒精处理干净，采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA ；
1.2、用于扩增的样品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于扩增的PCR反应体系和扩增条件
PCR反应体系:取50ng/ μ L的新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA是2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L,5U/y L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用灭菌去离子水补充至25 μ L ;
扩增条件:94.(TC预变性 8min ；94.(TC变性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35个循环；72.(TC延伸lOmin，得PCR扩增产物，4°C保存；
1.4、PCR扩增产物的检测方法
在水平电泳槽中制备质量百分比浓度为1.5%~1.8%的琼脂糖凝胶；将步骤1.3中的PCR扩增产物5μ1加入点样孔，在对比孔中加入5 μ? Marker DL 2000作为对比，其中，电泳电压为120V，电泳时间为40 min~60min ；
1.5、通过电泳图谱判断梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭
PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有三条特异性条带、在1000bp没有特异性条带、在IOObp~250bp有两条特异性条带的是梅花鹿鹿鞭；
PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有两条特异性条带、在1000bp有一条特异性条带、在IOObp~250bp有一条特异性条带的是新西兰赤鹿鹿鞭。
[0006]本发明的有益效果:
用DNA分子标记进行鉴别梅花鹿的鹿鞭与新西兰赤鹿鹿鞭操作步骤简单、快速灵敏，只需取极少量的样品就能提得足够用量的多聚酶链式反应(PCR)扩增的DNA模板，然后进行鉴别判定。该鉴别方法分辨力强、重现性好，可以澄清梅花鹿鹿鞭及其粉剂的真伪和优劣，减少了伪劣的中药材新西兰赤鹿鹿鞭给患者造成的经济损失以及健康的不良后果，保障群众用药安全具有中药意义，弥补传统中药鉴定中动物类中药鉴别的弱项，为临床合理用药提供科学依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是本发明梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭的电泳结果图。
[0008]图中:1-3为新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物，4-6为梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物，M-是Marker DL 2000。
【具体实施方式】
[0009]实施例1
新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物，引物的设计是根据梅花鹿的ISSrRNA基因序列(GenBank登录号是AY225108)来设计出引物，引物序列为:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0010]新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鉴别方法，其具体步骤如下:
1.1、新西兰赤鹿鹿鞭与梅花鹿鹿鞭的基因组DNA提取方法
将新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分别用酒精处理干净，取梅花鹿鹿鞭组织2g，取新西兰赤鹿鞭组织2g，采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA;
1.2、用于扩增的样品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于扩增的PCR反应体系和扩增条件
PCR反应体系:取50ng/ μ L的新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA是2 μ L，10 X PCR 的 BuffeK 10 倍的 PCR 的 Buffer)是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/μ L的上游引物和下游引物各I μ L，5U/ μ L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L，用灭菌去离子水补充至25yL；扩增条件:94.(TC预变性 8min ；94.(TC变性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35个循环；72.(TC延伸lOmin，得PCR扩增产物，4°C保存；
1.4、PCR扩增产物的检测方法
在水平电泳槽中制备质量百分比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶；将步骤1.3中的PCR扩增产物5μ1加入点样孔，在对比孔中加入5 μ? Marker DL2000作为对比，其中，电泳电压为120V,电泳时间为40 min ；
1.5、通过电泳图谱判断梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭 电泳结果如图1所示，梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有三条特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有两条特异性条带；
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在1000bp没有特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在1000bp有一条特异性条带；
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在IOObp~250bp有两条特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在IOObp~250bp有一条特异性条带。
[0011]实施例2
新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物，引物序列为:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0012]新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鉴别方法，其具体步骤如下:
1.1、新西兰赤鹿鹿鞭与梅花鹿鹿鞭的基因组DNA提取方法
将新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分别用酒精处理干净，取梅花鹿鹿鞭组织2g，取新西兰赤鹿鞭组织2g，采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA ；
1.2、用于扩增的样品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于扩增的PCR反应体系和扩增条件
PCR反应体系:取50ng/ μ L的新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA是2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L, 5U/ μ L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用灭菌去离子水补充至25 μ L ;
扩增条件:94.(TC预变性 8min ;94.(TC变性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35个循环；72.(TC延伸lOmin，得PCR扩增产物，4°C保存；
1.4、PCR扩增产物的检测方法
在水平电泳槽中制备质量百分比浓度为1.8%的琼脂糖凝胶；将步骤1.3中的PCR扩增产物5μ1加入点样孔，在对比孔中加入5 μ? Marker DL 2000作为对比，其中，电泳电压为120V,电泳时间为50min ；
1.5、通过电泳图谱判断梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有三条特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有两条特异性条带；梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在1000bp没有特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在1000bp有一条特异性条带；
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在IOObp~250bp有两条特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在IOObp~250bp有一条特异性条带。
[0013]实施例3
新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物，引物序列为:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0014]新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鉴别方法，其具体步骤如下:
1.1、新西兰赤鹿鹿鞭与梅花鹿鹿鞭的基因组DNA提取方法
将新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分别用酒精处理干净，取梅花鹿鹿鞭组织2g，取新西兰赤鹿鞭组织2g，采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA ；
1.2、用于扩增的样品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于扩增的PCR反应体系和扩增条件
PCR反应体系:取50ng/ μ L的新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA是2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L, 5U/ μ L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用灭菌去离子水补充至25 μ L ;
扩增条件:94.(TC预变性 8min ;94.(TC变性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35个循环；72.(TC延伸lOmin，得PCR扩增产物，4°C保存；
1.4、PCR扩增产物的检测方法
在水平电泳槽中制备质量百分比浓度为1.6%的琼脂糖凝胶；将步骤1.3中的PCR扩增产物5μ1加入点样孔，在对比孔中加入5 μ? Marker DL2000作为对比，其中，电泳电压为120V,电泳时间为50min ；
1.5、通过电泳图谱判断梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有三条特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有两条特异性条带；
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在1000bp没有特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在1000bp有一条特异性条带；
梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在IOObp~250bp有两条特异性条带，新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果在IOObp~250bp有一条特异性条带。
[0015]梅花鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果和新西兰赤鹿鹿鞭PCR扩增产物的电泳检测结果无论从带型和片段的大小上，样品之间都存在着差异，这是鉴定样品真伪和种属的多态性依据。
【权利要求】
1.一种新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鉴别引物，其特征是: 引物序列为: 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ； 下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
2.一种新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鉴别方法，其特征是: 具体步骤如下:· 1.1、新西兰赤鹿鹿鞭与梅花鹿鹿鞭的基因组DNA提取方法 将新西兰赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分别用酒精处理干净，采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA ； · 1.2、用于扩增的样品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ； 下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ； · 1.3、用于扩增的PCR反应体系和扩增条件 PCR反应体系:取50ng/ μ L的新西兰赤鹿鹿鞭基因组DNA和梅花鹿鹿鞭基因组DNA是·2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 ·2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L,5U/y L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用灭菌去离子水补充至25 μ L ; 扩增条件:94.0℃预变性 8min ;94.(TC变性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35个循环；72.(TC延伸lOmin，得PCR扩增产物，4°C保存； ·1.4、PCR扩增产物的检测方法 在水平电泳槽中制备质量百分比浓度为1.5%~1.8%的琼脂糖凝胶；将步骤1.3中的PCR扩增产物5μ1加入点样孔，在对比孔中加入5 μ? Marker DL 2000作为对比，其中，电泳电压为120V，电泳时间为40 min~60min ； · 1.5、通过电泳图谱判断梅花鹿鹿鞭和新西兰赤鹿鹿鞭 PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有三条特异性条带、在1000bp没有特异性条带、在IOObp~250bp有两条特异性条带的是梅花鹿鹿鞭； PCR扩增产物的电泳检测结果在250bp~500bp有两条特异性条带、在1000bp有一条特异性条带、在IOObp~250bp有一条特异性条带的是新西兰赤鹿鹿鞭。
【文档编号】C12Q1/68GK103525935SQ201310495476
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】张敏, 苏玉虹, 田玉民 申请人:张敏