枯草芽孢杆菌SMXP‑58菌株在烟梗中的应用的制作方法

本发明属于卷烟原料生产加工技术领域，具体涉及一株特定的枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在烟梗中的应用的专利申请。

背景技术：

烟梗是烟叶之粗硬叶脉，在烟叶中约占25%，是制作具有支撑作用的梗丝的主要原料。早期卷烟制备中，一般认为烟梗杂质较多，因而仅用于制备低档卷烟。但随着卷烟制备技术及健康意识的更新，现有卷烟制备中，一般认为适当含量梗丝的应用，不仅能提高烟丝的填充性，改善卷烟燃烧性，降低烟叶原料消耗，而且能有效降低卷烟焦油、烟碱、CO等有害物质的含量，其在叶组配方中使用比例呈逐渐增加的趋势。目前在一些卷烟产品中的使用比例已提高到22%，已成为卷烟配方中的重要组分之一。

烟梗中的果胶以α-1，4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸为基本结构，和纤维素一起构成了烟梗的细胞壁结构。已有研究表明，果胶含量的高低与烟梗品质密切相关，果胶含量过高，会使烟梗在燃吸时产生强烈的刺激感，严重制约卷烟制品整体品质的提高；同时，果胶在燃烧过程中会产生甲醇，甲醇进一步氧化成甲醛、甲酸等，对烟草吸食及安全性带来不利影响。

为改善烟梗质量，提升卷烟原料品质，需要有效降解烟梗中的果胶，使其含量保持在合理范围；而果胶等细胞壁物质结构性质较为稳定，在烟梗自然醇化过程中很难降解。以往研究中，一般认为烟叶的重要性要远高于烟梗的重要性，因而对于烟叶中果胶、蛋白质、淀粉等物质的降解进行了较多研究。但由于烟梗与烟叶在具体物质结构、物质含量方面等方面存在一些明显差异，因而以往烟叶中降解技术能否用于烟梗中、以及具体应用后的技术效果如何，是存在一定不确定性的。而随着梗丝应用的普遍推广，及对其重要性认识的逐步提升，研究和开发新的烟梗果胶降解技术，对提高卷烟品质，增加企业经济效益具有广泛而现实的意义。

技术实现要素：

在现有微生物菌株筛选基础上，发明人以前期筛选SMXP-58菌株为基础，发现将其用于新的烟草原料——烟梗后，同样具有较好地降低果胶含量的效果，因而可以促进卷烟原料品质的提升。

本申请所采取的技术方案详述如下。

枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在烟梗中的应用，应用时，制备成含有活菌的微生物菌剂，用于降解烟梗中的果胶；

进一步而言，将SMXP-58菌株制备成活菌数为（9~10）×10⁷个/mL的微生物菌剂，按烟梗（梗丝）1~3%质量比例，均匀喷洒于梗丝表面，在25℃~35℃、湿度65~75%的条件下，发酵处理48~96h，优选处理条件为：在30℃、湿度75%的条件下，发酵处理72 h；然后将梗丝加热处理（例如80℃条件下保温10~20min），使细菌及其产生的果胶酶失活即可；失活后梗丝即可按现有技术用于制备卷烟；

所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株，属芽孢杆菌属（Bacillus），最初由2013年三门峡产的复烤烟叶中分离而来，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌 SMXP-58，分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-58，于2016年3月10日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2016083，保藏地址为：武汉市武汉大学。

所述含有活菌的微生物菌剂，具体可通过如下步骤制备而成：

（1）活化菌种，将SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下培养1~2d；

（2）制备种子液，刮取步骤（1）中所培养的菌体，接种于液体LB培养基中，30℃、150 rpm条件于摇床过夜培养；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液按1%的体积比转接液体LB培养基，30℃、150 rpm条件于培养至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水进行充分悬浮，调整活菌数至适当数量后，即为用于降解烟梗中果胶的菌剂。

就枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株而言，现有研究相对较少，尽管已有研究认为其可以用于降解烟叶中果胶含量，但由于烟叶与烟梗在物质结构、物质成分方面存在较为明显的差异，因而该菌株是否可以用于降解烟梗中果胶、降低效果如何、是否具有应用价值是存在较大不确定性的，因而尚需进一步地实验加以研究确定。

本发明以烟梗中含量较高的果胶为作用目标，通过特定SMXP-58菌株的应用，以及特定剂量使用，在较短时间内较好地降低了烟梗中的果胶含量。初步测定结果表明，烟梗中果胶的降解率可达45%以上，表现出较好地降低烟梗中果胶含量的技术效果。

总体而言，本发明通过特定菌株的筛选，设计了较为简便的菌剂处理烟梗的技术方案，使得本发明具有：工艺流程较为简便，烟梗处理成本较低，且处理周期较短，可明显降低烟梗中的果胶含量并改善烟梗品质等技术优点，因而在卷烟制造技术领域具有较好地推广应用价值。

附图说明

图1为SMXP-58菌株在油镜下的形态图；

图2为基于SMXP-58菌株 16S rDNA基因序列构建的系统发育进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前就下述实施例中涉及部分物料、实验设备等情况简要介绍如下。

烟草物料：所用烟梗为2015年河南复烤后长烟梗，由河南中烟有限责任公司提供。

实施例1

本实施例仅就SMXP-58菌株的筛选及鉴定过程简要介绍如下。

SMXP-58菌株，最初是由2013年三门峡产的复烤烟叶中分离而来。其菌落在NA培养平板上圆形或不规则，呈乳白色，没有光泽，菌落表面平整或出现不规则褶皱凸起，表面粗糙不光滑，菌落不透明。油镜下形态如图1所示，可观察到细菌分布均匀，为杆状，很少呈链状，大小为(0.7~0.9)×(1.6 ~2)μm。

采用16S rDNA基因片段为通用引物，对该菌株进行PCR以及克隆测序，可获得1416bp序列，进行系统进化分析，显示菌株SMXP-58与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性高达99%，即，与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最近（如图2所示）。

最终，鉴定认为SMXP-58菌株属芽孢杆菌属（Bacillus），其分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-58，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2016083。

实施例2

为将实施例1中筛选所得SMXP-58菌株用于降解烟梗中果胶，需首先将该菌株制备成易于使用的菌剂，具体制备过程如下。

（1）活化菌种：将SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下于生化气候箱中培养1d；

（2）制备种子液：在超净工作台中刮取步骤（1）中所培养的菌体，接种于含有5mL液体LB培养基的18×180的试管中，30℃、150 rpm条件于摇床过夜培养；

（3）扩大培养：将步骤（2）中种子液按1 mL菌悬液/100 ml LB培养基（1%的体积比）转接于含100mL液体LB培养基的灭菌的250mL锥形瓶中，30℃、150 rpm条件于培养至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制备菌剂：将步骤（3）中菌液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水充分悬浮，调整活菌数为9.6×10⁷个/mL左右后，即为用于降解烟梗中果胶的菌剂。

实施例3

利用实施例2中所制备菌剂处理烟梗时，具体步骤为：

在制丝线上取供试梗丝，梗丝样品参数为：平均厚度为0.16 mm，平均长度为3.5 mm，然后均匀分成多份，每份100 g；

用喷雾器将实施例2所制备微生物菌剂均匀喷洒于梗丝表面，然后调整梗丝水分含量为25%。

为获得菌制剂的最佳作用条件，分别以菌制剂作用温度、湿度，以及时间为影响因素，进了3因素3水平正交试验设计（水平因素表（L9(3)³）），具体设计如下表1。

表1 正交试验因素水平L₉(3³)：

注：A为作用温度；B为作用湿度；C为作用时间。

依据上述3因素水平设计，进行了三因素三水平正交实验设计（表2）。

表2正交试验设计L₉(3³)：

注：A为作用温度；B为作用湿度；C为作用时间；同时，设置空白对照组（喷施等量蒸馏水作为对照）CK。

检测评价：

梗丝处理完成后，对其果胶含量进行测定，并换算果胶降解率，以确定最优菌制剂作用条件，并进一步将处理后梗丝按一定比例添加入配方烟丝中，评价其感官质量。

（一）果胶含量的测定

梗丝处理完成后，对梗丝中的果胶含量采用咔唑硫酸分光光度测定法进行测定；测定时首先绘制标准曲线，然后依据测定结果换算获得果胶含量变化情况，具体步骤为：

1、制作标准曲线

（1）准确称取分析纯半乳糖醛酸（G.A.）0.0500g，用蒸馏水溶解后定容于50mL容量瓶中(浓度1000mg/L)；

（2）于6个50mL容最瓶中分别吸取此液0、1、2、3、4、5mL，稀释至刻度(浓度0~100mg/L)；

（3）分别吸取不同浓度的标准稀释液1mL于6支试管(20mm×150mm)中，然后各加人浓硫酸6mL，用自来水边加边冷却至室温；

（4）然后各加入0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑无水乙醇溶液，摇匀；

（5）在室温下暗处放置1.5h，在540nm波长下用1cm比色皿，以试剂空白（G.A.浓度为0的稀释液）作参比，测定吸光度(A)，绘制A一C标准曲线。

、样品测定

（1）发酵结束后，80℃处理梗丝20 min，使细菌及其产生的果胶酶失活；

（2）准确称取0.040g梗丝样品粉末于50mL烧杯中；

（3）加入10mL、0.5mol/L硫酸、15mL水，搅匀，在75℃水浴中水解15min，冷却至室温后定容于50mL容量瓶中；

（4）然后，准确移取5.00mL该液于另一50 mL容量瓶，稀释至刻度，吸取10倍稀释液1mL于6支试管(20mm×150mm)中，然后各加人浓硫酸6mL，用自来水边加边冷却至室温；

（5）然后各加入0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑无水乙醇溶液，摇匀；

（6）在室温下暗处放置1.5h，在540nm波长下用1cm比色皿，以试剂空白（G.A.浓度为0的稀释液）作参比，测定吸光度(A)，再根据标准曲线计算其浓度。

、计算

计算公式为，G.A.%=[C×50/(5×50)]÷[W×10⁶]×100%；

式中：C为从标准曲线查得的所测果胶液中G.A.的浓度(mg/L)，W为烟梗样品粉末质量(g)；根据不同烟梗样品中G.A.的含量不同，可计算出相应梗丝中果胶的含量，并参比对照样品进行果胶降解率的换算，并进一步进行极差分析。

具体计算结果如下表3：

表3 梗丝果胶降解率的极差分析：

注：A为作用温度；B为作用湿度；C为作用时间。

对上表分析可以看出：由于在一定范围内，梗丝果胶降解率越高越好，而k₂＞k₃＞k₁，因此选择A₂为因素A（A代表作用温度）的优水平，同理B、C（分别代表作用湿度、作用时间）的优水平分别为B₃、C₃，所以最优水平组合为A₂B₃C₃，即作用温度为30℃，作用湿度为75%，作用时间为72 h。

由于最优化组合并不在9组正交处理方案中，因此对优化处理方案进行了验证实验，通过换算果胶降解率发现，此处理下梗丝果胶降解率达到最高，为51.1%。

综上所述，当菌剂在作用温度为30℃，作用湿度为75%，作用时间为72 h的条件下处理梗丝时，果胶降解率可达51.1%。

（二）感官质量评价

按照15%的比例将菌制剂处理（最优条件处理）后的梗丝添加入配方烟丝中，经恒温恒湿箱平衡后，由专业评委对香气质（A）、香气量（B）、浓度（C）、柔细度（D）、余味（E）、杂气（F）、刺激度（G）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，感官评吸总分为各分项得分总和。评价结果如表4。

表4 感官评价结果：

。

从表4中数据可以看出，按照15%的比例将菌制剂处理完成后的梗丝添加入配方烟丝中，与对照样品相比，处理后香气量、香气质有所提升，柔细度、杂气、刺激明显改善，总得分提高1.03分，整体感官质量提升较为明显。

总体而言，本申请中筛选获得的SMXP-58菌株，其来源于烟叶中原有菌株，当利用其所制备菌剂处理烟梗时，在确保对于烟梗中果胶降解同时，不具有明显的副作用，可较为有效的促进烟草中大分子物质降解形成各类有利于提高烟草品质的小分子物质，进而达到降低卷烟烟气中的有害成分，改善烟梗的内在品质的目的。