柽柳金属硫蛋白基因的cDNA及其编码的多肽的制作方法
【专利摘要】柽柳金属硫蛋白基因的cDNA及其编码的多肽，它涉及金属硫蛋白基因的cDNA及其编码的多肽。它要解决植物抗重金属镉离子能力低的问题。柽柳金属硫蛋白基因的cDNA的基因序列如SEQ?ID?No.1所示。柽柳金属硫蛋白基因的cDNA序列编码的多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明是克隆木本植物柽柳的金属硫蛋白基因，将其转入到模式植物烟草中，可提高转基因烟草的抗重金属镉离子的能力，转基因烟草的抗镉离子的能力比对照提高10％以上，在镉离子胁迫条件下株高和鲜重明显比对照好。
【专利说明】柽柳金属硫蛋白基因的cDNA及其编码的多肽
【技术领域】
[0001] 本发明涉及金属硫蛋白基因的cDNA及其编码的多肽。
【背景技术】
[0002] Cd2+不是植物生长发育的必需微量元素，具有很强的毒性。Cd2+抑制植物细胞生 长，抑制氧化磷酸化，引发氧化胁迫，影响光合作用，损伤核仁和影响质膜ATP酶的活力。 Cd2+污染不仅使土壤肥力退化，作物产量和品质下降，水环境恶化，而且通过食物链进入人 体，直接影响和危及人类的健康。如何治理被重金属污染的土壤已经成为国际性的难题。传 统的治理方法主要采用物理或化学方法，成本高，且只能小面积进行。而种植植物修复被重 金属污染的土壤则成本低，且可大规模实施。因此，利用基因工程技术培育抗重金属污染的 植物新品种是人们追求的目标。柽柳是沙漠植物，抗干旱、耐盐碱能力极强，在Cd 2+和盐胁 迫条件下该基因大量表达。利用农杆菌介导法将从柽柳中克隆的金属硫蛋白基因（MT-3) 转入烟草，可以明显提高转基因烟草抗Cd 2+离子的能力，为利用柽柳金属硫蛋白基因改良 植物新品种提供优良基因资源。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是为了解决植物抗重金属镉离子能力低的问题，而提供柽柳金属硫蛋 白基因的cDNA及其编码的多肽。
[0004] 本发明柽柳金属硫蛋白基因的cDNA基因序列，包含5'端非翻译区（1-145)、蛋白 质编码区（146-388)和3'端非翻译区（389-421)，具体序列如SEQ ID No. 1所示。
[0005] 本发明柽柳金属硫蛋白基因的cDNA基因序列编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0006] 本发明是克隆木本植物柽柳的金属硫蛋白基因，将其转入到模式植物烟草中，可 提高转基因烟草的抗重金属镉离子的能力，转基因烟草的抗镉离子的能力比对照提高10% 以上，在镉离子胁迫条件下株高和鲜重明显比对照好。
【专利附图】
【附图说明】
[0007] 图1为本发明中转基因株系Northern杂交分析的电泳图，其中SR-1 :为非转基因 烟草对照；T-1?T-5 :为烟草转基因株系。
【具体实施方式】
[0008] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0009] 一：本实施方式柽柳金属硫蛋白基因的cDNA基因序列，包含5'端非 翻译区（1-145)、蛋白质编码区（146-388)和3'端非翻译区（389-421)，具体序列如SEQ ID No. 1所示。
[0010] 本实施方式中柽柳金属硫蛋白基因的cDNA基因全长为421bp，具体序列如下所 示：
[0011] ATGCAGGCTAACAGTACCGAAATATCAACGCTGCATTAAAGATCTGAGCAAACTCACTCATTCCTTTAC AGATCAATATACTTTGTGATCCTTTTCCTTCTCAGATAGCCAGCGATTTCTCGTAAGTTTGAATTTATCACAAAAAA TGTCGTGCTGTGGCGGAAACTGTGGTTGTGGCGCTGACTGCAAGTGCGGCAACGGCTGCGGAGGATGCAAGATGAAC CCTAGCTTGGGCTACACCGAGACAAGCAGCGACAACGTGGCTCTCATCACCGGAGTTGCTCCCAAAACAACATTCGC CGATGGAGCCGAGATGGGATTAGGAGCTGAGAATGGAGGCTGCAAGTGCGGAGCTGACTGCAAGTGCGACCCCTGCA CCTGCAAGTGAATCTAAGATTGATTAGGGAAAAAAAAAAAAAAA〇
[0012] 本实施方式中柽柳金属硫蛋白基因是按照以下方法得到的：
[0013] ①利用RNA提取试剂盒提取柽柳的总RNA，利用cDNA合成试剂盒将之反转录成 cDNA ；
[0014] ②根据前期获得的金属硫蛋白基因的EST序列设计引物，引物 FI: 5 ' -TGTCGTGCTGTGGCGGAAAC-3 ' 和引物 R1:5 ' -CCCTAATCAATCTTAGATTC-3，以柽柳 cDNA 为 模版，用5' /3' RACE试剂盒对未知区域进行克隆，获得全长金属硫蛋白基因的cDNA序列， 命名为：TaMT3 ;
[0015] ③将本实施方式中所得柽柳金属硫蛋白基因的cDNA构建到植物表达载体pBI 121 植物表达载体中，利用农杆菌介导法将其转入到烟草基因组；结果表明在属镉离子胁迫条 件下转基因烟草株系的苗高和鲜重均比非转基因株系高10%以上，差异达到极显著水平。
【具体实施方式】 [0016] 二：本实施方式柽柳金属硫蛋白基因的cDNA基因序列编码的多肽 的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0017] 本实施方式中柽柳金属硫蛋白基因的cDNA基因序列编码的多肽的氨基酸序列包 括80个氨基酸，序列如下：
[0018] MSCCGGNCGCGADCKCGNGCGGCKMNPSLGYTETSSDNVA
[0019] LITGVAPKTTFADGAEMGLGAENGGCKCGADCKCDPCTCK。
[0020] 本实施方式花椰菜病毒（CaMV) 35S启动子驱动的金属硫蛋白基因 cDNA的植物表 达系统。
[0021] 将【具体实施方式】一的所得柽柳金属硫蛋白基因的cDNA构建到植物表达载体 PBI121中，利用农杆菌介导法将其转入到烟草基因组。利用Northern杂交检测外源基因的 表达情况，见图1，结果表明外源柽柳金属硫蛋白基因在转基因烟草中得到了正确表达。
[0001] 序列表 <110>东北林业大学 <120>柽柳金属硫蛋白基因的cDNA及其编码的多肽 <160〉4 <210> 1 <211〉421 <212> DNA <213> 柽柳属(Tamai'ix L.) <220> <221>CDS <222> (146)...(388) <400> 1 atgcaggcta acagtaccga aatatcaacg ctgcattaaa gatctgagca aactcactca 60 ttcctttaca gatcaatata ctttgtgatc cttttccttc tcagatagcc agcgatttct 120 cgtaagtttg aatttatcac aaaaa atg teg tgc tgt ggc gga aac tgt ggt tgt 175 Met Ser Cys Cys Gly G.ly Asn Cys Gly Cys 丄 5 丄0 ggc get gac tgc aag tgc ggc aac ggc tgc gga gga tgc aag atg aac cct 226 Gly Ala Asp Cys Lys Cys Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Asn Pro 15 20 25 age ttg ggc tac acc gag aca age age gac aac gtg get: etc ate acc gga 277 Ser Leu Gly Tyr Thr Glu Thr Ser Ser Asp Asn Val Ala Leu lie Thr Gly 30 35 40 gtt get ccc aaa aca aca ttc gee gat gga gee gag atg gga tta gga get 328 Val Ala Pro Lys Thr Thr Phe Ala Asp Gly Ala Glu Met Gly Leu Gly Ala 45 50 55 60 gag aat gga ggc tgc aag tgc gga get gac tgc aag tgc gac ccc tgc acc 379 Glu Asn Gly Gly Cys Lys Cys Gly Ala Asp Cys Lys Cys Asp Pro Cys Thr 65 70 75 tgc aag tgaatetaag attgattagg gaaaaaaaaa aaaaaa 421 Cys Lys 80 <210〉2 <21l>80 <212> PRT <213> 柽柳属(TamarixL.)
[0002] <400> 2 Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ala Asp Cys Lys 15 10 15 Cys Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Asn Pro Ser Leu Gly 20 25 30 Tyr Thr Glu Thr Ser Ser Asp Asn Val Ala Leu lie Thr Gly Val 35 40 45 Ala Pro Lys Thr Thr Phe Ala Asp Gly Ala Glu Met Gly Leu Gly 50 55 60 Ala Glu Asn Gly Gly Cys Lys Cys Gly Ala Asp Cys Lys Cys Asp 65 70 75 Pro Cys Thr Cys Lys 80 <2I0>3 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 引物 FI <400> 3 tgtcgtgctg tggcggaaac 20 <210〉 4 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> 引物 R1 <400> 4 ccctaatcaa tcttagattc 20
【权利要求】
1. 柽柳金属硫蛋白基因的CDNA，其特征在于该基因包含5'端非翻译区（1-145)、蛋白 质编码区（146-388)和3'端非翻译区（389-421)，具体序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 柽柳金属硫蛋白基因的cDNA序列编码的多肽，其特征在于该基因编码的多肽的氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
【文档编号】C07K14/825GK104099343SQ201410336564
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】周博如, 姜廷波, 姚文静, 王升级, 王继颖 申请人:东北林业大学