含有人SLC3A2基因的慢病毒载体及其构建方法与流程

文档序号:12346460阅读:来源:国知局

技术特征:

1.构建含有SLC3A2基因的慢病毒载体的方法,包括以下步骤:

(A)用PCR方法扩增SLC3A2基因;

(B)将目的基因SLC3A2克隆到慢病毒载体中;

(C)制备感受态细胞;

(D)将步骤(B)制备的慢病毒载体转化感受态细胞;

(E)从平板上挑取克隆菌落,小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆;

(F)纯化提取的质粒,将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(A)中所使用的引物为:

正向引物:5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’

反向引物:5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤(A)包括:

oligo设计,目的基因SLC3A2序列片段根据编号NM_001012662.2设计,上下游引物分别加上NotI和BamHII及保护碱基,用于载体的亚克隆;用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应,用Y164-1和Y164-62进行第二轮PCR反应,模板为第一轮PCR反应的产物。第一轮PCR可得到混有目的基因的非单一条带的PCR产物混合物,然后再用第一轮的PCR产物为模板,通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带,PCR反应完成后,利用电泳并切胶回收SLC3A2基因片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,步骤(B)包括:用NotI和BamHI对SLC3A2基因片段进行酶切,37℃酶切2小时;用NotI和BamHI对载体LV5进行酶切,37℃酶切2小时。电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收SLC3A2基因片段和载体LV5,用T4 DNA ligase连接双酶切得到的SLC3A2基因片段和线性化的载体,22℃连接2小时。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,步骤(D)包括:从-70℃冰箱中取出感受态细胞,将装有其离心管冰上放置4min,待细胞解冻后,加入步骤(B)制备的10μl连接产物,轻柔混匀内容物,在冰中放置30min;将离心管放到42℃的水浴锅中放好的试管架上,在90s后,取出离心管;快速将离心管转移到冰浴中,使细胞冷却3min;向每支离心管加入800μl不含抗生素的LB培养基,然后将离心管转移到37℃摇床,250转/分钟,培育45min使细菌复苏;取200μl培育后的细胞均匀涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin);等平板上液体消失后,将平板倒置放置于37℃培养箱中,培养16h。

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