一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法与流程

本发明涉及一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

伽马氨基丁酸(gaba)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，广泛分布在动植物体中，研究发现，伽马氨基丁酸具有改善心血管，治疗神经疾病，改善肝肾功能和调节内分泌系统等重要作用，因此它在药物治疗和功能性食品方面具有广阔的应用前景。

制备伽马氨基丁酸的方法主要有化学法、动植物富集法和微生物合成法三大类方法。化学合成法在生产中使用了有毒的化学试剂，生产得到的伽马氨基丁酸不能添加到食品中；而伽马氨基丁酸在动植物中含量很低，通过植物富集法来得到伽马氨基丁酸面临着成本过高的问题；微生物合成法是指利用微生物细胞内含有的谷氨酸脱羧酶生物催化l-谷氨酸钠(l-msg)发生脱羧反应制备伽马氨基丁酸。

采用乳酸菌等野生菌发酵生产伽马氨基丁酸面临着培养周期长、产酶效率低、分离提纯步骤复杂等缺点；用大肠杆菌表达外源谷氨酸脱羧酶虽然酶活能大大提高，但由于大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在发酵过程中会产生内毒素，所以利用大肠杆菌为生产菌株生产伽马氨基丁酸不能用于食品工业。枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵食品的历史，被美国fda和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株，它具有培养简单快速、蛋白分泌能力强、表达的蛋白不易形成包涵体、非致病性等特点，是目前生产各种工业用酶的理想表达宿主。

技术实现要素：

本发明提供一株表达谷氨酸脱羧酶的食品级安全的重组枯草芽孢杆菌，并可用于转化谷氨酸钠制备伽马氨基丁酸，对生产食品级的伽马氨基丁酸具有重要的意义。

本发明的技术方案如下：

一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）sk44.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno：m2016774，其为将重组质粒pub-hpaii-p43-gad-dal导入宿主细胞wb600(dal^-)而得到的，其组成为wb600/pub-hpaii-p43-gad-dal，其能够合成氨基酸序列seqidno.1的谷氨酸脱羧酶。

一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

所述的谷氨酸脱羧酶的编码基因是以来源于密码子优化后的乳酸乳球菌lactococcuslactissubsp.lactisil1403的gad基因克隆得到的，原始gad核酸序列如seqidno.2所示，优化后的gad核酸序列如seqidno.3所示

一种载体质粒pub-hpaii-p43-dal，其核酸序列为seqidno.4。

一种重组质粒pub-hpaii-p43-gad-dal，包含了所述优化后的gad核酸序列seqidno.3和pub-hpaii-p43-dal中核酸序列seqidno.4。

所述的表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括将来源于密码子优化后的乳酸乳球菌lactococcuslactissubsp.lactisil1403的gad基因序列(其优化后的核酸序列如seqidno.3)和双启动子表达载体pub-hpaii-p43-dal(其核酸序列如seqidno.4)通过pcr方式融合得到质粒pub-hpaii-p43-gad-dal；并将质粒转化到含d-丙氨酸缺陷型筛选标记的枯草芽孢杆菌wb600(dal^-)中表达，获得一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌wb600/pub-hpaii-p43-gad-dal，命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sk44.001，保藏编号cctccno：m2016774。

具体步骤为：

（1）宿主细胞wb600(dal^-)的构建：wb600(dal^-)是d-丙氨酸消旋酶基因缺陷的枯草芽孢杆菌，

（a）在枯草芽孢杆菌wb600染色体上的d-丙氨酸消旋酶基因dal的上下游各选取900bp左右长度的片段作为同源臂，通过pcr将两段同源臂扩增，并胶回收；选取lox71-spc-lox66抗性基因片段作为筛选标记，将上下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合pcr将三段基因连接在一起；将pcr产物转入枯草芽孢杆菌wb600感受态中，在含有壮观霉素spc的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌wb600染色体上的d-丙氨酸消旋酶基因dal，得到d-丙氨酸缺陷型的宿主wb600(dal^-)-spc。

（b）将ptsc(bacillusgeneticstockcenteraccessionno.ece204)质粒导入上述宿主wb600(dal^-)-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在iptg(异丙基硫代半乳糖苷)的诱导下，表达重组酶cre，在重组酶cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，将spc抗性基因删除，并获得一株d-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌wb600(dal^-)。

（2）以p7和p8为引物，以质粒pet-22b-gad为模板，pcr扩增得到线性片段1。

（3）以p9和p10为引物，以质粒pub-hpaii-p43-gad-dal为模板，pcr扩增得到线性片段2。

（4）以线性片段1和线性片段2互为引物，pcr扩增得到多聚体片段。

（5）采用两步(gmi、gmii)法制备无抗生素抗性的枯草芽孢杆菌wb600(dal^-)感受态细胞。

（6）将步骤（4）的多聚体片段转化到步骤（5）得到的感受态细胞中，涂布在不添加抗生素不添加丙氨酸的lb平板，筛选得到重组菌株wb600/pub110-p43-hpaii-gad-dal。

重组枯草芽孢杆菌(wb600/pub-hpaii-p43-gad-dal)的发酵过程如下：

种子液培养：挑取平板上的单菌落，接种于4mllb试管培养基中，37℃，200r/min培养12h。所述lb培养基配方为：胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l；采用去离子水配制，灭菌条件为121℃，20min。

发酵培养：按体积分数2%将种子液转接到50ml发酵培养基中，37℃，200r/min培养20h后得到最终发酵液。所述发酵培养基配方为：大豆蛋白胨25g/l；乳糖5g/l；na2hpo4·12h2o3g/l；mnso4·h2o0.1g/l；采用去离子水配制，灭菌条件为115℃，30min。

所述的重组枯草芽孢杆菌wb600/pub-hpaii-p43-gad-dal的应用，表达的谷氨酸脱羧酶能催化谷氨酸钠或谷氨酸生产伽马氨基丁酸（gaba），可以在化学、食品及制药领域中应用。

本发明的有益效果：本发明构建了一种能够高效表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，使其在特定的发酵培养基培养条件下能够高效表达谷氨酸脱羧酶，所构建的工程菌株蛋白表达能力强，没有内毒素污染的威胁，安全可靠，发酵液的酶活力最高可达8.6u/ml。本发明所得到的谷氨酸脱羧酶，能够以l-谷氨酸钠为底物，在温和的条件下通过生物转化得到伽马氨基丁酸，工艺简单，环境友好，该重组菌在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。

生物材料样品保藏：一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：中国武汉，武汉大学，保藏日期2016年12月21日，分类命名为枯草芽孢杆菌sk44.001（bacillussubtilis）sk44.001，保藏编号为cctccno：m2016774。

附图说明

图1：pcr得到的产物的核酸电泳图。m、dl5000dnamarker；1、线性片段1；2、线性片段2；3、多聚体片段。

图2：重组质粒pub-hpaii-p43-gad-dal的构建图谱。

图3：重组枯草芽孢杆菌wb600/pub-hpaii-p43-gad-dal的生长曲线和酶活曲线。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。

实施例1：d-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌wb600(dal^-)的构建

以质粒p7s6为模板，引物对p3/p4将lox71-spc-lox66抗生素抗性基因片段扩增并回收。在枯草芽孢杆菌wb600染色体上的d-丙氨酸消旋酶基因dal两侧选择800-900bp长度的片段作为同源区域，将两端的同源区域分别用引物对p1/p2和p5/p6扩增并回收。用引物对p1/p6将两端同源臂片段与抗生素lox71-spc-lox66通过pcr技术融合在一起。

pcr反应体系：0.2mlpcr管中按顺序加入以下试剂：上下游引物各1.5μl；5μlphusionhfbuffer(5×)；2μl10mmdntpmix(2.5mmeach)；2μl上游同源臂；0.5μllox71-spc-lox66；2μl下游同源臂；0.5μlphusionhigh-fidelitydna聚合酶；加蒸馏水至终体积50μl。

pcr扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。

将pcr产物转化至枯草芽孢杆菌wb600感受态，在含有抗生素spc和d-丙氨酸的平板上进行筛选，得到一株wb600(dal^-)-spc。

导入ptsc质粒（南京农业大学，闫新博士惠赠，ncbiaccessionno.eu864234），在iptg的诱导下表达cre重组酶，在重组酶的作用下，lox71和lox66位点发生重组，抗性基因spc被删除。

最终获得d-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌wb600(dal^-)。

实施例2：食品级安全质粒pub-hpaii-p43-gad-dal的构建

材料与试剂：dna聚合酶primestarmaxdnapolymerase(2×)和dl5000dnamarker购自大连宝生物工程有限公司；sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒和sanprep柱式dna胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；质粒pet-22b-gad由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其他常用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

以p7，p8为引物，pet-22b-gad为模板，pcr扩gad基因，

反应体系：

pet-22b-gad1μl

p71.25μl

p81.25μl

ddh2o21.5μl

primestarmaxdnapolymerase(2×)25μl

反应条件：98℃预变性2min；98℃解链10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。

以p9，p10为引物，pub-hpaii-p43-dal为模板，pcr扩增pub-hpaii-p43-dal基因(与模板相比有与gad基因重叠的片段)，

反应体系：

pub-hpaii-p43-dal1μl

p81.25μl

p91.25μl

ddh2o21.5μl

primestarmaxdnapolymerase(2×)25μl

反应条件：98℃预变性2min；98℃解链10s，55℃退火5s，72℃延伸1min20s，共30个循环；72℃延伸5min。

胶回收纯化pcr产物，用nanodrop测定两个线性片段的浓度，按照摩尔比1︰1互为模版pcr，得到多聚体片段。

反应体系：

gad1μl

pub-hpaii-p43-dal1μl

ddh2o23μl

primestarmaxdnapolymerase(2×)25μl

反应条件：98℃预变性2min；98℃解链10s，60℃退火5s，72℃延伸1min50s，共30个循环；72℃延伸5min。

将多聚体片段导入枯草芽孢杆菌wb600(dal^-)感受态细胞，在lb平板上培养，筛选得到工程菌wb600/pub-hpaii-p43-gad-dal。

实施例3重组枯草芽孢杆菌的发酵表达谷氨酸脱羧酶

在平板上挑取单菌落接种于4mllb培养基中，37℃，200r/min培养12h；按照体积分数2%的接种量将种子液接入50ml发酵培养基，37℃，200r/min培养至21h，定时取样测发酵液的od600与酶活(图3)。

所涉及的培养基配方：

lb培养基：胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l；采用去离子水配制，灭菌条件为121℃，20min。

发酵培养基：大豆蛋白胨25g/l；乳糖5g/l；na2hpo4·12h2o3g/l；mnso4·h2o0.1g/l；采用去离子水配制，灭菌条件为115℃，30min。

发酵酶活定义：50℃，ph4.5的反应条件下，每分钟产生1μmol伽马氨基丁酸所需的酶量定义为1个酶活单位(u/ml)。

发酵酶活测定方法：反应总体积1ml，其中包括：ph4.5、0.1mol/l醋酸盐缓冲液，0.1mol/l谷氨酸钠，1ml发酵液离心下来的菌体。

反应条件：温度50℃，时间10min。

反应结束后沸水煮10min灭酶，离心取上清后采用hplc检测。

seqidno.1

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alatyrproleuprolysasnleugluasngluileileglnarg

410415420

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valglnaspmetglnglualaileglualaleuasnlysalahis

440445450

ileleutyrhisglugluprogluasnlysthrtyrglyphethr

455460465

his***

466

seqidno.2

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seqidno.3

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seqidno.4

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