]rict-1(mg360)，sgk_l(ok538)，pept-1(lgl601)，unc-31(el69)，
[0069]tyra-3 (ok325)以及
[0070]uls57[unc_119p::YFP+unc_119p::sid-l+mec_6p::mec_6] ;lin_15B(n744)。
[0071]除了 unc-31RNAi克隆是单独设计的，其余所有RNAi质粒均从Ahringer库中提取并经过测序后转入0P50 (xu363)中。
[0072]所有RNAi喂食试验均从线虫卵开始延及整个寿命周期。RNAi实验中，含有空载L4440或者RNAi质粒的HT115，和含有空载L4440或者RNAi质粒的0P50 (xu363)单克隆，在含有羧苄(100 μ g/mL)的LB培养基中37°C培养过夜，并在实验两天前将新鲜的RNAi菌接到线虫生长培养基(NGM，含有25 μ g/mL羧苄和ImM IPTG)。
[0073]线虫在HTl 15上发育得比在0P50和0P50 (xu363)上快(图4中A)，通过在HTl 15或者0P50 (xu363)上的RNAi都足以诱导和突变体一样的表型，消除了两种细菌食物造成的影响(图4中B，C，D)，这表明RNAi是一种研宄饮食对发育的差分调节背后遗传基础的有效工具。
[0074]发育速率试验
[0075]通过让100只产卵期的线虫成虫产30分钟卵来同步化。在L4时期时，每种食物来源的20只虫子被转入有相应细菌的单独的NGM中，并每30分钟连续观测直到其第一次产卵。数据表示为平均卵-卵时间土平均数标准误如图4。
[0076]油红O染色
[0077]每株系大约500只同步化的I日龄成虫用IX磷酸盐缓冲液(PBS)洗下来，洗下来的虫子洗两次再用375 μ LPBS重悬，然后加入500 μ L现配的2XMRWB (160mM KCl, 40mMNaCl, 14mM Na2EGTA, ImM Spermidine HCl, 0.4mM Spermine, 30mM NaPIPES, pH7.4,0.2%beta-ME)和125 μ L16%多聚甲醛，室温放置30分钟后用Tris-HCl缓冲液(lOOmM，pH7.4)洗两次，加入还原缓冲液(10mM Tris-Cl pH7.4，1mM DTT)室温放置30分钟。接着离心后用I XPBS洗两次，用60%异丙醇重悬脱水(15分钟，室温)。待异丙醇去完后用Iml油红O溶液室温孵育过夜(油红0，以下简称ORO溶液如下准备:0.5g ORO溶入10ml无水异丙醇并通过震荡平衡两天得到ORO贮液；0R0染色溶液需要现配现用，混合60 % ORO贮液和40 %蒸馏水并用0.2 μπι注射式滤器过滤)。ORO染色的虫子直接固定到有琼脂糖垫(2%琼脂糖溶于1XPBS)的载玻片上，并通过连有数字彩色C⑶摄像头的立式复合显微镜(OlympusBX51)成像。为了定量测定脂含量，得到的图像通过ImageJ软件去掉背景并转换为灰度图，然后比较不同条件处理虫子的信号强度。每组实验至少分析了 30只虫子如图5。
[0078]耗氧量和ATP含量
[0079]耗氧率(OCR)通过Seahorse XF24分析仪实时测量。通过重力分选用M9缓冲液(3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, andlmLIM MgSO4溶于 IL 蒸馏水)将同步化的 I 日龄虫子从NGM板子上冲洗下来并洗三次。Seahorse联板每个孔转入50?300只虫子，使用厂商建议的标准步骤测量耗氧量(OCR)。用测量得到的OCR值除以分析虫子数得到最终耗氧量ATP含量分析时，用M9收集约1000只I日龄同步化的成虫并洗三次，三次冻融循环后，将虫子置于M9中煮沸15分钟，离心之后分析上清中ATP含量(ATP Determinat1n Kit, LifeTechnologies)和蛋白浓度(Bradford Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific)。得到的数据通过蛋白总量标准化后得到ATP含量如图6。
[0080]寿命试验
[0081]所有寿命实验均在20 °C条件下进行，方法参照文献Hsu et al., 2009 ；Xiaoet al., 2013ο所有实验中，将成虫第一天算为第一天，每次寿命试验中使用了 100只虫子，每2?3天将其转到新的60mm NGM板子上，每板10只虫子；如果虫子爬出板子、爆裂或者变得松弛，将会被除开；所有RNAi上的寿命试验均从卵开始并始终在RNAi板子上进行。所有统计分析均用 raphPad Prism5 (GraphPad Software, Inc.)和 IBM SPSSStatisticsl9 (IBM, Inc.)软件完成，P值用对数秩法(Kaplan-Meier)得到。可以看出过去在HT115上得到的影响寿命基因，同时能在0P50(xu363)重现出来，如图7。
[0082]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种基因工程大肠杆菌0P50品系，其特征在于，该大肠杆菌0P50品系的基因组中，敲除了 rnc基因，且attB位点插入有IPTG诱导的T7RNA聚合酶基因序列。
2.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌0P50品系，其特征在于，rnc基因序列部分插入有miniTnlO转座子。
3.根据权利要求2所述的基因工程大肠杆菌0P50品系，其特征在于，所述miniTnlO转座子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1?2所示。
4.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌0P50品系，其特征在于，所述T7RNA聚合酶基因序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
5.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌0P50品系，其特征在于，名称为大肠杆菌Escherichia coli 0P50 (xu363)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC M2015138。
6.权利要求1?5任一所述的基因工程大肠杆菌0P50品系的制备方法，其特征在于，将来自rnc_大肠杆菌K8024的miniTnlO转座子引入rnc基因中；将IPTG诱导的T7RNA聚合酶基因序列插入到attB位点，得到基因工程大肠杆菌0P50品系。
7.根据权利要求6所述的基因工程大肠杆菌0P50品系的制备方法，其特征在于，具体步骤为: 敲除rnc基因:通过质粒转染的方法将来自rnc—大肠杆菌K8024的miniTnlO转座子引入0P50的rnc基因中； 插入T7RNA聚合酶基因序列:通过Red/ET介导的同源重组一个两侧是两个FRT位点的卡那霉素抗性基因首先引入到大肠杆菌BL21 (DE3) ybhC和IacI基因中间，然后携带整个编码T7聚合酶的基因片段和此卡那霉素抗性组件通过PCR扩增并通过第二步Red/ET介导的同源重组插入到经rnc基因敲除处理的0P50的attB位点，最后再通过FLP介导的重组将卡那霉素抗性组件去掉，最终得到的菌经PCR测序确认，获得所述基因工程大肠杆菌0P50品系。
8.权利要求1?5任一所述的基因工程大肠杆菌0P50品系作为秀丽隐杆线虫的食物在研宄饮食对动物生命活动影响研宄中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种基因工程大肠杆菌OP50品系及其制备方法和应用，该品系的基因组中，敲除了rnc基因，且attB位点插入有IPTG诱导的T7RNA聚合酶基因序列，实现了同时在OP50品系中破坏rnc基因表达以及增加T7聚合酶表达。喂食该基因工程大肠杆菌OP50品系的线虫在发育、代谢、行为以及衰老上无法与喂食传统OP50的虫子区分开，表明其适合用来培养线虫。该品系作为基因工具的开发铺平了通过利用线虫的全基因组筛选来系统剖析饮食信号和肠道微生物相互作用背后的遗传道路。本发明的基因工程大肠杆菌OP50品系这种RNAi工具还可以在避开饮食差异的影响中得到其他研究中的广泛应用。CCTCC M 201513820150319
【IPC分类】C12N1-21, A01K67-033, C12R1-19, C12N15-70
【公开号】CN104762249
【申请号】CN201510170094
【发明人】许献忠, 刘剑峰
【申请人】密歇根大学, 华中科技大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月10日