成熟胚经不同时间预培养再进行转化后的转化结果图；
图3为本发明对结缕草预培养成熟胚转化成功后的状态图，箭头所指为GUS染色斑点。
【具体实施方式】
[0021]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0022]实施例1
1)I)从结缕草成熟种子中剥离出胚，分为5组，将胚置于愈伤诱导培养基MT4培养基中培养；其中，第I组培养3天，第2组培养4天，第3组培养5天，第4组培养6天，第5组培养7天；设置两个对照组，对照组I采取上述方法培养I天，对照组2采取上述方法培养2天；将含有植物抗性选择基因如?基因和β -葡萄糖苷酸酶基因济/6报告基因的pMDC99IG质粒是通过冻融法转入农杆菌ΕΗΑ105菌株中；于200rpm、28°C下，对含有上述外源质粒的农杆菌进行培养，培养基含有5g L1酵母提取物、1g L 1细菌蛋白胨、5g L 1氯化钠、50mgL 1卡拉霉素，pH为7.0，培养至OD _=0.3-0.6，然后在3500rpm下对所得培养菌液进行离心20 min收集；利用MT4-S液体培养基对农杆菌进行重悬，调节悬浮液的0D_=0.5 ;
2)将步骤I)培养所得植物组织置于步骤2)所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养I小时；
3)取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的MT4-S固体培养基中分别避光共培养3天、5天、7天和9天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mg L 1O
[0023]共培养后，将步骤4)所得物置于⑶S染色剂中，37°C孵育过夜，次日对⑶S蓝色斑点进行计数。1ml的⑶S染色剂含有50mg L1的X-Gluc (溶于二甲基甲酰胺中)0.lml、500mM 磷酸盐缓冲剂 lml、100% 甲醇 2ml 和 0.5% Triton X-100 6.9ml。
[0024]转化结果如图2所示，对照组I和对照组2均未转化成功，当培养3天(第I组)以上时，转化成功。转化的效率随着培养时间上升而提高。
【主权项】
1.一种结缕草的高效农杆菌转基因方法，其特征在于，所述方法包括步骤: O从结缕草成熟种子中剥离出胚，将胚置于愈伤诱导培养基中培养至少3天； 2)对含有外源质粒的农杆菌进行活化，利用液体愈伤继代培养基对农杆菌进行悬浮，得到农杆菌悬浮液 3)将步骤I)培养所得植物组织置于步骤2)所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养I小时； 4)取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的固体愈伤继代培养基中避光共培养至少3天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mg L 1O2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤I)的培养时间为7天。3.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤4)中，共培养时间为9天。4.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤2)中农杆菌的活化方法为:于200rpm、28°C下，对含有外源质粒的农杆菌进行培养，培养基含有5g L 1酵母提取物、1gL1细菌蛋白胨、5g L 1氯化钠、50mg L 1卡拉霉素，pH为7.0，培养至OD 6。。=0.3-0.6。5.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，利用MT4-S液体培养基对农杆菌进行悬浮时，调节悬浮液的OD6tw=0.5。6.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述外源质粒为含有植物抗性选择基因如?基因和β-葡萄糖苷酸酶基因讲6.报告基因的PMDC99IG质粒。7.根据权利要求6所述的转基因方法，其特征在于，所述含有植物抗性选择基因hpt基因和β -葡萄糖苷酸酶基因济/6报告基因的PMDC99IG质粒是通过冻融法转入农杆菌中的。8.根据权利要求1、4、5、7中任一项所述的转基因方法，其特征在于，所述农杆菌菌株为 ΕΗΑ105。9.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括:30 g L1蔗糖、4 mg L 1维生素Bl、100 mgL 1C1-酮戊二酸、5 mg L1 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L-1-节氨基腺嘌呤，所述愈伤诱导培养基的PH值为5.8，用2g L 1植物凝胶固化；所述液体愈伤继代培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括:30 g L1鹿糖、4 mg L 1维生素Bl、100 mgL 1C1-酮戊二酸、2 mg L1 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L-1-节氨基腺嘌呤，所述液体愈伤继代培养基的PH值为5.8 ;所述固体愈伤继代培养基的pH值为5.8，用2g L 1植物凝胶固化。10.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤I)前对结缕草成熟种子进行预处理，所述预处理步骤包括: A)将种子在水中浸泡2天； B)置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗。
【专利摘要】本发明提供了一种结缕草的高效农杆菌转基因方法，其特征在于，所述方法包括步骤：1）从结缕草成熟种子中剥离出胚，将胚置于愈伤诱导培养基MT4培养基中培养至少3天；2）对含有外源质粒的农杆菌进行活化，利用液体愈伤继代培养基MT4-S液体培养基对农杆菌进行悬浮，得到农杆菌悬浮液；3）将步骤1）培养所得植物组织置于步骤2）所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养1小时；4）取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的MT4-S固体培养基中避光共培养至少3天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mg/L。本发明转基因操作过程耗时短，仅需不足10天；无需复杂的操作，易于实施。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN105039393
【申请号】CN201510542670
【发明人】王迅, 马啸, 汪志辉, 张新全, 付刚, 赖云松, 梁东, 林立金, 唐懿, 夏惠
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月31日