反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mLX3CH2C12萃取， 合并萃取相，用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残 余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物IV-1，白色固体，ESI-MS，m/z= 199([M+H]+)。
[0025] 步骤B.化合物V-1的合成
[0026] 化合物IV-1(1. 19g，6mmol)溶于10mL干燥的THF中，搅拌，在氮气气氛中冷却 到-20 °C，而后用注射器慢慢滴加1. 6M的n-BuLi的正己烷溶液（3. 75mL，6mmol)，滴加 完毕后，反应混合物在该温度下继续搅拌1小时。用注射器再慢慢滴加1，2-二氯乙烷 (0. 99g，lOmmol)溶于3mL干燥的THF制成的溶液，滴加完毕后，反应混合物在该温度下搅 拌半小时，而后升温至室温再搅拌过夜。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用 50mLX3CH2C12萃取，合并萃取相，用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋 转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物V-1，白色固体，ESI-MS，m/z= 261([M+H]+) 〇
[0027] 步骤C.化合物1-1的合成
[0028] 化合物V-1(0. 78g，3mmol)溶于10mL干燥的甲苯中，在氮气气氛中加热回流过夜， TLC显示反应完成。反应混合物冷却到室温后，加入10mL正己烷，搅拌1小时，抽滤收集固 体，室温下真空干燥，得到化合物1-1，白色固体，ESI-MS，m/z= 225([M-C1 ]+)。
[0029]实施例2化合物1-2的合成
[0030]
[0031] 步骤A.化合物IV-1的合成
[0032] 化合物II_l(1.08g，lOmmol)溶于10mL干燥的THF中，搅拌，在氮气气氛中冷却 至卜20°C，而后用注射器慢慢滴加1. 6M的n-BuLi的正己烷溶液（6. 25mL，lOmmol)，滴加完 毕后，反应混合物在该温度下继续搅拌1小时。用注射器再慢慢滴加III-2(1.85g，lOmmol) 溶于3mL干燥的THF制成的溶液，滴加完毕后，反应混合物在该温度下搅拌半小时，而后升 温至室温再搅拌过夜。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用50mLX3CH2C12萃取， 合并萃取相，用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，残 余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物IV-2,白色固体，ESI-MS，m/z= 213([M+H]+)。
[0033] 步骤B.化合物V-2的合成
[0034] 化合物IV-2(1. 27g，6mmol)溶于10mL干燥的THF中，搅拌，在氮气气氛中冷却 到-20 °C，而后用注射器慢慢滴加1. 6M的n-BuLi的正己烷溶液（3. 75mL，6mmol)，滴加 完毕后，反应混合物在该温度下继续搅拌1小时。用注射器再慢慢滴加1，2-二氯乙烷 (0. 99g，lOmmol)溶于3mL干燥的THF制成的溶液，滴加完毕后，反应混合物在该温度下搅 拌半小时，而后升温至室温再搅拌过夜。反应混合物小心倾倒入200mL冰水中，搅拌，用 50mLX3CH2C12萃取，合并萃取相，用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤除去干燥剂，滤液在旋 转蒸发仪上蒸干，残余物使用硅胶柱层析纯化，得到化合物V-2,白色固体，ESI-MS，m/z= 275 ([M+H]+)。
[0035] 步骤C.化合物1-2的合成
[0036] 化合物V-2(0. 82g，3mmol)溶于10mL干燥的甲苯中，在氮气气氛中加热回流过夜， TLC显示反应完成。反应混合物冷却到室温后，加入10mL正己烷，搅拌1小时，抽滤收集固 体，室温下真空干燥，得到化合物1-2,白色固体，ESI-MS，m/z= 239([M-C1 ]+)。
[0037] 实施例3-9
[0038] 参照实施例1、2的方法，合成了下表所列化合物。
[0039]
[0040]
[0041]实施例10化合物体外对TAK激酶的抑制作用
[0042] 使用如下文指定的测试，针对化合物抑制JAK1、JAK2和JAK3的能力来筛选化合 物。
[0043]使用杆状病毒表达系统，使人JAK1 (aa850_1154)、JAK2(aa826_1132)、JAK3(aa795 -1124)和TYK2(aa871-1187)的催化结构域表达为N端GST融合蛋白且其购自Carna Biosciences。使用生物素标记的肽一聚（GT)-生物素（CisBio)-作为底物来测定酶的洁 性。反应中的肽浓度对于JAK1为60nM、对于JAK2为20nM、对于JAK3为140nM且对于TYK2 为 50nM。通过TR-FRET(时间分辨焚光能量转移（time-resolvedfluorescenceenergy transfer))法来检测磷酸化的程度。对于在 8mMMOPS(pH7.0)、10mMMgCl2、0.05% 疏 基乙醇、0. 45mg/mLBSA中的含有酶、ATP和肽的反应混合物中的各激酶测量化合物的IC5。。 反应中的ATP浓度对于JAK1为3yM、对于JAK2为0. 2yM、对于JAK3为0. 6yM且对于TYK2 为1. 8yM。酶法反应在室温下进行30分钟。然后用20yL含有0. 115yg/mL抗缴氨酸磷 酸化（phosphoTyr) (PT66)-穴状化合物（CisBio)以及可变浓度的SA-XL665 (CisBio)的浮 灭检测缓冲液（50mMHEPES、0. 5MKF、EDTA0. 25M、0. 1% (w/v)BSA，pH7. 5)未停止反应以 保持SA-B比率恒定。孵育3小时，然后在设定为读取荧光共振能量传递的Victor2V光谱 焚光计（PerkinElmer)上读取。
[0044]
[0045] 从上表结果可以看出，本发明的化合物对JAK具有很强的抑制作用，可以作为制 备治疗免疫性、炎性、自身免疫性或变应性疾病，或者移植排斥等疾病的药物。
【主权项】
1. 具有通式I结构的化合物，其中，R选自H，（：「(：3的烷基，C3-Cs的环烷基。2. 权利要求1所定义的通式I化合物，选自：3. 合成权利要求1-2任一所定义的属于通式I的化合物的方法：^ V； 化合物II先用强碱处理，再与化合物III反应，得到化合物IV;化合物IV先用强碱处 理，再与1，2-二氯乙烷反应，得到化合物V;化合物V在加热下发生分子内取代反应，得到 化合物I;其中，所述强碱选自正丁基锂、异丁基锂、叔丁基锂、苯基锂、二异丙基氨基锂，所 述X=Cl、Br、I，R的定义如权利要求1-2所述。4. 权利要求1-2之一所定义的通式I化合物在制备治疗免疫性、炎性、自身免疫性或变 应性疾病，或者移植排斥等疾病药物方面的应用。
【专利摘要】本发明涉及一类含吡啶盐结构的酪氨酸激酶抑制剂、其制备方法、以及在制备治疗免疫性、炎性、自身免疫性或变应性疾病，或者移植排斥等疾病药物中的应用。其中，R选自H，C1-C3的烷基，C3-C8的环烷基。
【IPC分类】A61P37/08, C07D471/04, A61P37/06, A61P29/00, A61P37/02
【公开号】CN105111204
【申请号】CN201510500868
【发明人】曾华仙
【申请人】天津小新医药科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月14日