连接，在0. 2血微量离屯、管中，加入PMD18-TVectorlμレ胶回收后的抗菌肤基因2yLddHzO2μL^，Solution1(冰上融 化）5yL，全量为lOyL;混合均匀后瞬时离屯、；放入连接仪中，4°C，1化，合成的pMD18-T/ CC34进行PCR、双酶切等鉴定结果如图3、4。
[0061] b构建抗菌肤的重组表达载体
[0062] 抗菌肤基因的克隆载体及表达载体的双酶切：
[0063] 将含有表达载体PHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10μg/mLCm的LB培养基中， 37°C200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20°C保存的鉴别正确的克隆质粒分别进行 双酶切，酶切体系如下：
[0064]
阳0化]酶切反应条件为：37°C水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、PMD-18T/CC34质 粒。取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离屯、，使溶液聚集在试管底部，37°C水浴化 后，酶切反应完全。取5μΙ反应液与ΙμΙ eXLoading Buffer混合均匀，在含有邸的1% Agarose gel电泳检测。电泳检测正确后，将剩下15 μL的双酶切液进行胶回收。 阳066] 抗菌肤基因与表达载体ΡΗΤ43的连接：
[0067] 将酶切好的CC34基因片段和酶切后的质粒ΡΗΤ43进行连接，即可构建成质粒载体 PHT43/CC34,连接反应体系如下：
[0068]
[0069] 连接反应条件为：16°C水浴，过夜。重组表达载体进行PCR、双酶切等鉴定结果如 图 5、6。
[0070] (1)构建基因工程菌：
[0071] 挑取宿主菌WB800N的单菌落接种于2血SPI培养基中，置于50血离屯、管中，200r/ min、37°C摇床中过夜培养，从中取100μL转接于5mL的SPI培养基中，在摇床中相同条件 培养，化后开始测ODe。。值，每20分钟一次，0D抑。值在0. 6-0. 8之间时，从中取200μL菌液 转接于2血SPII培养基中置于50血离屯、管内，摇床培养90min(37°C、200;r/min)。到90min 后迅速加入20yL100XEGTA溶液，在培养lOmin。最后分装，每0. 5血一份，置于1. 5血离 屯、管中，-80°C保存。取枯草芽抱杆菌WB800N感受态细胞0. 5血置于一个无菌的1.5血EP 管中，同时加入10μL质粒，轻轻混匀，在37°C、200r/min摇床中，培养90min后8000g离心 弃掉350μL上清液，重悬菌体。取适量的菌液涂布于含有10μg/mLCm的LB平板上，37°C 恒溫培养箱过夜培养。
[0072] (2)诱导表达产物纯化鉴定：
[0073] 挑取对照菌（含空载质粒PHT43的枯草芽抱杆菌WB800脚和重组菌PHT43/CC34/ WB800N各一个单菌落，分别接种于5.OmLLB液体培养基（含Cm5yg/mL)中。37°C，200rpm 空气振荡培养箱培养过夜，该菌液作为种子液。取种子液500μL置于50mL的LB培养基 (含Cm)中，注入250mLΞ角瓶中，37°C，200巧m空气振荡培养箱培养，当菌液0成。。皿为0. 85 时开始诱导（t= 0)，添加IPTG(体积浓度为0. 8mmol/L)。诱导24h之后取样，lOOOOg，4°C 离屯、lOmin，从上清液中取20μL与等体积的2XSDS上样缓冲液混合，超声波破碎Imin，接 着沸水浴lOmin，制备成蛋白样，用于Tricine-SDS-PAGE检测结果如图7。将PHT43/CC34/ WB800N重组菌表达上清液通过Mini超滤系统5000kda膜分离，分离液过G50层析柱后上 液相分离。取3μL分析级HPLC分析粗品，流动相是水和乙腊，进行30min的梯度洗脱。首 先将HPLC用含95%的水和5%的乙腊的起始梯度平衡lOmin。然后注入准备好的样品，反 应时间为40min，收集从检测器中出来的样品。最后用25%的水和75%的乙腊混合液清洗 30min，HPLC检测CC34的出峰时间在10-12min之间，纯度为95. 75%。
[0074] 实施例2
[00巧]将实施例1得到的纯化产物CC34进行活性检测。
[0076]最小杀菌浓度采用96孔板法测定。挑平板中大肠杆菌、停乳链球杆菌、金黄色 葡萄球菌、沙口氏菌、短乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌、双歧杆菌、毕赤酵母SMD1168和 毕赤酵母GS115的单菌落于适宜液体培养基中，四种致病菌37°C，200rpm空气震荡培养 过夜，四种乳酸菌厌氧37°C，200巧m震荡培养过夜，两种毕赤酵母30°C，200巧m空气震 荡培养 4她。将抗菌肤用 1XPBS分级稀释为：2000、1500、750、500、375、250、187. 5、125、 93.75、62.5、46.875、31.25、23.475 和 15.625μM共计16个梯度。将培养后的菌液稀释至 2X105-7Xl〇5c即/mL，将稀释好的测试菌液分别滴加到3个96孔培养板中，每行的1-12 孔，每孔60μ以然后每孔滴加20μL的抗菌肤，每孔加120μL培养基。每个样品设定3个 重复，同时W不含测试菌作为阴性对照，四种致病菌的于37°C，恒溫培养，转速为10化pm， 培养24h;四种乳酸菌的37°C，厌氧恒溫培养，培养24h;两种毕赤酵母的30°C，恒溫培养， 转速为1(Κ)巧m，培养4她。用肉眼观察无浑浊的，即为受试菌的最小抑菌浓度（MIC)。最小 杀菌浓度采用96孔板法测定。将MIC前所有孔的混合液取5μL移入相应新鲜培养基96孔 板中，然后进行培养4她，观察结果，没有混浊可W当做99. 5%的原始种入的细菌被杀死， 即为该菌的最低杀菌浓度（MBC)。结果见表1.
[0077] 表1抗菌肤CC34的最小抑菌浓度（MIC)和最小杀菌浓度（MBC)
[0078]
[0079] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W作出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建 511、 设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列 F1 ： 5r -GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3r R1-.5'-ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3, F2 ： 5r -GGCCAACATACCCGTGATGCCATCCTGCCGATTCTGAGCCTGATTGGTGGTCTG-3r R2 ： 5r -TCCCCCGGGTTATTTACCCAGCAGACCACCAATCAGGCTCAGAATC-3r 512、 将引物FI与Rl、F2与R2分别进行延伸，得到延伸液Pl、P2。具体步骤如下： 提前开起PCR仪预热，将2XTaqMasterMix25yL、上游引物？1(10以]\1)2 4 1^下游引物 Rl(10yM)2yL、RNase-Freewater21yL加入到PGR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置 于PCR仪中，反应条件为：94°C预变性2min;30个循环；72°C终延伸2min，得延伸液P1。重 复以上工艺，得延伸液P2 ; 513、 以第一次PCR得到的延伸液P1与P2相互作为彼此的模板和引物进行PCR，具 体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将 2XTaqMasterMix25yL、Pl0.5yL、P2 0.5yL、 RNase-Freewater24μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应 条件为：94°C预变性2min;30个循环；72°C终延伸5min，得抗菌肽基因； 514、 将所得的抗菌肽基因与克隆载体pMD18-T载体连接，在0. 2mL微量离心管中， 加入PMD18-TVectorlyL，胶回收后的抗菌肽基因2yL，ddH202yL，Solution1(冰上 融化）5yL，全量为10yL;混合均匀，瞬时离心后，置于连接仪中，4°C，12h，得pMD18-T/ CC34 ； 515、 将含有表达载体pHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10μg/mLCm的LB培养基中， 37°C200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20 °C保存的鉴别正确的克隆质粒分别进行 双酶切，酶切体系如下：XballyL、SamllyL、质粒DNA10yL、CutSmartBuffer2yL、灭 菌的双蒸水6yL;酶切反应条件为：37°C水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、pMD-18T/ CC34质粒； 516、 取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37°C水浴 3h后，酶切反应完全； 517、 将酶切好的CC34基因片段和酶切后的质粒pHT43进行连接，即可构建成质粒载 体PHT43/CC34,连接反应体系如下：CC34 基因 6yL、10XT4DNAligaseBufferlyL、质粒 pHT43 2. 5μL、T4DNAIigase0. 5μL;连接反应条件为：16°C水浴，过夜； 52、 重组表达载体pHT43/CC34转化到宿主细胞中，构建三种表达工程菌菌株； 53、 将步骤S2得到的表达工程菌以IPTG为诱导剂表达，获得表达产物； 54、 分离纯化步骤S3所得的表达产物，获得抗菌肽蛋白CC34,并检测其正确性。2. 根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所 述步骤S2中的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB800N。3. 根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所 述步骤S3中所述表达产物为离心上清液。4. 根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所 述步骤S4中所述分离纯化采用高效液相色谱法（HPLC)纯化，利用质谱法（MS)检测其正确 性。5. 根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所 述步骤S4中所述分离纯化鉴定正确的抗菌肽CC34,在制备治疗革兰氏阴和/或革兰氏阳性 菌疾病药物、动物饲料添加剂中的应用。6. 根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所 述步骤312和步骤513中的30个循环为94°(：变性3〇8,66°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8。
【专利摘要】本发明公开了抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，通过分子生物学技术，选择表达载体pHT43构建重组表达载体，成功构建了重组表达载体pHT43/CC34，将重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，得到表达工程菌pHT43/CC34/WB800N。在LB培养基中，经IPTG诱导表达，表达产物采用高效液相色谱法(HPLC)纯化，得到CC34蛋白，利用质谱法(MS)检测其正确性。本发明方法在枯草芽孢杆菌WB800N中表达了抗菌肽CC34，分离纯化简单，易操作。表达产物对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性，对有益菌无抑菌活性，热稳定性好，适于大规模工业化生产，可应用于医药、食品、饲料添加剂以及养殖领域。
【IPC分类】C12N15/75, C12R1/125
【公开号】CN105255935
【申请号】CN201510763095
【发明人】姜宁, 李凌岩, 张爱忠, 张晨雪, 朱双, 祁丽, 全佳慧, 黄福佳, 张伟庆
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月4日