量PCR反应
[0069] 1、将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照。
[0070] 2、荧光检测通道选择（以ABI7500仪器为例）：
[0071] 1)选择FAM(Reportere:FAM,Quencher:None)检测通道；2)内标选择HEX或VIC 通道检测（Reporter:VIC,Quencher:None)。参比焚光（PassiveReference)设置为R0X〇
[0072] 3、荧光定量PCR反应条件见表1 :
[0073] 表1:荧光定量PCR反应条件
[0074]
[0075] 四、结果分析
[0076] 反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可 以手动调苄基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值。扩增曲 线与阈值线的交点，称为ct值（cyclethreshold，PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈 值时所经历的循环数值）。如图1所示，如果某反应管中样本扩增曲线呈S型，有Ct值且 Ct< 39,则可以判为相应的突变位点检测呈阳性；如图2所示，如果样本扩增曲线平直，无 Ct值显示（Undet)显示，可以判为相应的突变位点检测呈阴性。
[0077] 本发明应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索到的 PIK3CA基因序列，在 6 种（E542K、E545K、E54ro、H1047R、H1047L和H1047Y)突变的位置，针 对6种突变设计了 12条特异性ARMS引物以及4条公用下游引物、4条公用探针，经优化，筛 选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出PIK3CA基因的6种突变，并且在50ng/ 反应的野生型DNA背景下不能检测出野生型PIK3CA基因，说明本发明试剂盒具有很好的特 异性以及抗干扰能力，大大降低了假阳性发生率。另外，对PCR反应体系进行了优化组合， 利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防 前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控 DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。荧光定量PCR扩 增结束后，通过曲线形状及Ct值判断阴阳性，检测结果可作为临床对赫赛汀（Herceptin) 和拉帕替尼（Lapatinib)用药情况检测的参考，用做临床辅助诊断。
[0078] 特异性和灵敏度试验表明：试剂盒检测企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为 1〇〇%，灵敏度参考品的检测结果符合质量标准。
[0079] 精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数〈5%。
[0080] 野生型耐受性试验表明：本试剂盒在50ng/反应的野生型人DNA背景下无非特异 扩增信号。
[0081 ] PCR产物污染的预防试验表明：本发明的快速检测试剂盒中加入内标，可以有效 监控假阴性的存在。PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。
[0082] 临床样本的检测试验表明：本试剂盒可检出50ngDNA样本中低至1 %的PIK3CA基 因突变。
[0083] 以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明 的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0084] 以上所述仅是本发明的【具体实施方式】，使本领域技术人员能够理解或实现本发 明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PIK3CA基因突变核酸检测 试剂盒包括：PCR反应液，所述PCR反应液包括E542K突变检测反应液、E545K突变检测反应 液、E54?突变检测反应液、H1047R突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和H1047Y突 变检测反应液，且上述6种检测反应液均包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和用于靶 多核苷酸检测的探针。2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述E542K 突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为： 上游引物：5' -CAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTA-3'； 下游引物：5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。3.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述E545K 突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为： 上游引物：5' -CACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTA-3'； 下游引物：5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。4.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述E545D 突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为： 上游引物：5' -GAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAT-3'； 下游引物：5' -CAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC-3'。5.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述E542K 突变检测反应液、E545K突变检测反应液和E54?突变检测反应液中所述用于靶多核苷酸 检测的探针的碱基序列均为：5' FAM-CAGGAGAAAGATITTCTATGGAGTCACAGGTAAGT-BHQ13'。6.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述H1047R 突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为： 上游引物：5' -ATGAAACAAATGAATGATGCACG-3'； 下游引物：5' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3'。7.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述H1047L 突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为： 上游引物：5' -TCATGAAACAAATGAATGATGCTCT-3'； 下游引物：5' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3'。8.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述H1047Y 突变检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列为： 上游引物：5' -TCATGAAACAAATGAATGATGCAT-3'； 下游引物：5' -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTC-3'。9.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述H1047R 突变检测反应液、H1047L突变检测反应液和H1047Y突变检测反应液中所述用于靶多核苷 酸检测的探针的碱基序列均为：5' FAM-ATGGTGGCTGGACAACAAAAATGGATT-BHQ13'。10.根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述E542K 突变检测反应液、所述E545K突变检测反应液、所述E54?突变检测反应液、所述H1047R突 变检测反应液、所述H1047L突变检测反应液和所述H1047Y突变检测反应液内均含有用于 内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针，其中，所述上下游引物和所述探针的 喊基序列分别为： 上游引物：5' -GTAATTGCTGAAGCAATCAGGAAA-3' ； 下游引物：5' -ACTTGCCCTGATATTCTAAAACACAG-3' ； 探针：5' -HEX-AACTCGAAGTATGTTGCTATCCTCTGAACAACTAA-BHQ1-3' ； 所述内标片段的碱基序列为： 5'-ACCAGAACAAGTAATTGCTGAAGCAATCAGGAAAAAAACTCGAAGTATGTTGCTATCCTCTGAACAACTA AAACTCTGTGTTTTAGAATATCAGGGCAAGTATATT-3 '。11. 根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述 E542K突变检测反应液、所述E545K突变检测反应液、所述E54?突变检测反应液、所述 H1047R突变检测反应液、所述H1047L突变检测反应液和所述H1047Y突变检测反应液内 均含有10XPCR反应缓冲液和脱氧核糖核苷三磷酸，其中，所述10XPCR反应缓冲液包括： 200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L的氯化镁溶液、500mmol/L的氯化钾 溶液、体积百分比为〇. 2%的曲拉通溶液和体积百分比为10%的甲酰胺溶液；所述脱氧核 糖核苷三磷酸包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。12. 根据权利要求1所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于，所述 PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶 和尿嘧啶DNA糖基化酶。13. 根据权利要求1-12任一项所述的PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，其特征在于， 所述PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒还包括PIK3CA阳性对照和PIK3CA阴性对照。
【专利摘要】本发明提供一种PIK3CA基因突变核酸检测试剂盒，包括：PCR反应液，所述PCR反应液包括E542K、E545K、E545D、H1047R、H1047L和H1047Y？6种类型的突变检测反应液，且所述6种反应液均包括10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物和下游引物、用于检测靶多核苷酸的探针、用于内标片段扩增的上下游引物以及用于检测内标的探针。本试剂盒操作快速、检测灵敏度高，应用本试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的PIK3CA基因突变进行快速检测，为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349680
【申请号】CN201510887624
【发明人】戴立忠, 吴康, 汤链, 黄临迷
【申请人】湖南圣维基因科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月7日