抗生素抗性的各种酶。
[0047] 在另一个优选的实施方案中，所述宿主微生物包含编码至少两种一级调节剂化合 物的一种或多种核酸分子，每种一级调节剂化合物能够催化多步化学转化反应的至少一个 反应，且其中所述化学转化反应中的至少一个产生所述效应物化合物。
[0048] 在另一个优选的实施方案中，所述微生物宿主细胞包含编码至少两种潜在一级调 节剂化合物的一种或多种核酸分子，其中至少一种一级调节剂化合物会实现底物向所述效 应物化合物的化学转化，且至少一种一级调节剂化合物将所述底物转运进所述微生物中。
[0049] 在另一个方面，本发明涉及微生物宿主细胞的文库，所述微生物宿主细胞的文库 适合用在从潜在一级调节剂化合物群体中选择一级调节剂化合物的方法中，每个所述宿主 细胞包含：
[0050] a)编码至少一种潜在一级调节剂化合物的至少一种核酸分子，
[0051] 其中所述一级调节剂化合物
[0052] -实现底物向所述效应物化合物的化学转化，且将所述底物提供给所述微生物； 或者
[0053] -将所述效应物化合物转运进所述微生物中；和
[0054] b)至少一种可调节的基因表达构建体，其包含编码至少两个或更多个调节序列 的核酸分子，每个所述调节序列编码包含可操作地连接到各个编码区的核糖开关的RNA分 子，所述编码区编码各个二级调节剂化合物用于调节各个生长调节剂化合物的作用，其中 每个核糖开关响应于效应物化合物的存在而调节它的各个编码区的表达。
[0055] 在另一个方面，本发明涉及一种微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少一 种如本文中所述的可调节的基因表达构建体和编码至少一种一级调节剂化合物的至少一 种核酸分子，其中所述一级调节剂化合物
[0056] -实现底物向所述效应物化合物的化学转化；或者
[0057] -将化合物从细胞外空间转运至细胞内空间，其中所述转运蛋白化合物是所述底 物或是所述效应物化合物。
[0058] 在最后一个方面，本发明涉及一种产生一级调节剂化合物生产菌株的方法，其中 通过转基因方法将所述选择的遗传编码序列或根据本文所述方法选择的序列引入微生物 宿主细胞中由此产生生产菌株，其中所述生产菌株生产一种或多种所述一级调节剂化合 物。
[0059] 定义
[0060] 本文中使用的"效应物化合物"表示这样的化合物：其结合至核糖开关并在所述核 糖开关中造成构象变化，由此调节它的各个编码区的表达。
[0061] 本文中使用的"一级调节剂化合物"表示这样的化合物：其调节效应物化合物的作 用，其中所述一级调节剂化合物实现底物向效应物化合物的化学转化或将所述效应物化合 物转运进微生物中。
[0062] 本文中使用的"二级调节剂化合物"表示这样的化合物：其调节生长调节剂化合物 的作用。
[0063] 本文中使用的"生长调节剂化合物"表示这样的化合物：其抑制细胞的生长，使得 细胞在有所述生长调节剂化合物存在下不再增殖。
[0064] "克隆"是指将DNA插入载体中、然后将它建立为细胞系的稳定部分的方法。
[0065] 本文中使用的术语"表达载体"表示这样的DNA分子：其用于将特定核酸序列引入 靶细胞中并表达。一旦表达载体位于细胞内，由所述核酸序列编码的潜在一级调节剂化合 物通过细胞转录和翻译机制而产生。通常，这些表达载体包括可操作地连接到编码特定基 因的核酸（即候选生物催化剂的核酸和/或检测基因）的调节元件。
[0066] "转录"表示在DNA或RNA模板上合成RNA。"翻译"表示在mRNA模板上合成蛋白。 当一个核酸与另一个核酸序列发生功能联系时是"可操作地连接的"。例如，如果核糖开关 影响编码序列的翻译，则所述核糖开关可操作地连接到所述序列。
【附图说明】
[0067] 将参考附图进一步描述和解释本发明，在附图中：
[0068] 图1显示了构成'核糖开关平台'的221个碱基对DNA序列（从终止子至起始密 码子），所述序列的表达产生对于结合茶碱而言特异性的核糖开关。
[0069] 图2显示了携带双重核糖开关选择系统的pGEB05. 1载体。
[0070] 图3图示了包含两类一级调节剂化合物的生产途径的细胞，所述一级调节剂化合 物调节效应物化合物的作用。
[0071] 图4图示了正选择方法的一个优选实施方案。
[0072] 图5图示了负选择方法的一个优选实施方案。
[0073] 一个优选实施方案的概要
[0074] 下面提供了关于如本文中所述的选择方法的工作方式的其它细节。
[0075] 基本系统设计
[0076] -般方案是检测包含一级调节剂化合物的宿主细胞的存在，所述一级调节剂化合 物使用两个或更个识别效应物化合物的核糖开关调节所述效应物化合物的作用。每个核糖 开关控制编码区的表达，所述编码区又给所述细胞赋予存活能力。至少两个核糖开关的应 用对于该方法的成功而言是关键性的，因为这会显著地减小在宿主细胞中产生自发抗性的 机会。
[0077] 通过将效应物化合物的检测与在选择条件下的存活偶联，所述系统将生长与一级 调节剂化合物的细胞内形成相关联。
[0078] 核糖开关
[0079] 核糖开关是要表达的RNA分子的表达控制元件，且其当被效应物化合物结合时改 变构象状态。核糖开关通常可以分成两个单独的结构域：一个选择性地结合靶标（适体结 构域），另一个影响遗传控制（表达平台结构域）。这两个结构域之间的动态相互作用会导 致基因表达的控制。
[0080] 核糖开关以两种不同的模式起作用：0FF(关）和ON(开）。
[0081] OFF核糖开关（本文中使用的'负选择'）是在效应物化合物与适体结构域结合 以后关闭基因表达的核糖开关（即构象变化会掩蔽不允许表达有关基因的核糖体结合位 点）。
[0082] ON核糖开关（本文中使用的'正选择'）是在效应物化合物与适体结构域结合以 后允许基因表达的核糖开关（即构象变化会暴露允许表达有关基因的核糖体结合位点）。
[0083] 核糖开关的'切换'在本文中表示在效应物化合物与核糖开关结合以后核糖开关 的状态的变化。效应物化合物是可以实现核糖开关的切换的分子和/或化合物。这包括造 成核糖开关的切换的天然的或正常的效应物化合物以及可以造成核糖开关的切换的其它 化合物。
[0084] 要用在本发明中的核糖开关通常可以来自任何来源，包括天然存在的核糖开关、 嵌合的核糖开关、经工程改造的核糖开关和重组的核糖开关。核糖开关描述在美国专利 申请公开号US 2005/0053951、美国专利号6, 831，171、PCT申请公开号WO 2006/055351、 美国临时专利申请号60/625, 864、美国专利申请号US2009/0305253、欧洲专利申请号EP 2322535和PCT申请公开号WO 2011/088076中，它们中的每一篇特此通过引用整体并入，并 用于描述核糖开关和它们的功能。
[0085] 要求核糖开关是可选择的，使得它具有对期望的效应物化合物的特异性结合，使 得所述核糖开关将对所述效应物化合物做出应答，以致于所述宿主细胞将在其存在下增 殖。用于筛选和选择核糖开关和/或活化核糖开关的化合物的方法可以参见本领域，例如 美国专利申请号US 2009/0305253和US 2013/0004980、欧洲专利申请号EP 2322535和 PCT申请公开号WO 2011/088076,它们中的每一篇特此通过引用整体并入，并用于筛选和 选择核糖开关的方法。
[0086] 编码区
[0087] 本文中使用的"编码区"编码二级调节剂化合物且涉及：
[0088] -正选择：基因和/或核酸序列，其表达产生调节生长调节剂化合物的作用的一种 或多种化合物，任选地通过化学改变所述生长调节剂化合物，使得所述生长调节剂化合物 不再抑制包含所述编码序列的宿主生物体的生长。这样的化学改变可以是、但不限于，有毒 的或抑制生长的化合物的化学灭活或碳源的化学修饰，使得所述经修饰的碳源可以被营养 缺陷型微生物利用。
[0089] -负选择：基因和/或核酸序列，其表达产生可以化学上改变非细胞毒性化合物的 一种或多种化合物，使得所述化合物变成抑制细胞生长的细胞毒性剂（即生长调节剂化合 物）。
[0090] 本发明中的编码区可操作地连接到核糖开关。编码区的目的是，允许选择一个或 多个含有一级调节剂化合物的宿主细胞，所述选择基于：效应物化合物与核糖开关的适体 的结合会造成核糖开关的变化，使得在它的各个编码区的表达中得到的变化允许细胞生 长。
[0091] 在本文描述的可调节的基因表达构建体中的每个独立编码区编码不同的二级调 节剂化合物，使得每个二级调节剂化合物对不同的生长调节剂化合物起作用。
[0092] 本领域已知的多种基因适合用作本发明中的编码区。对于正选择，这样的基因包 括、但不限于：抗生素抗性基因，补充宿主细胞中的营养缺陷型的基因，和在特定条件下允 许生长的其它基因，所述特定条件不允许不含有或不表达这些相同基因的宿主细胞的生 长。这样的条件包括、但不限于：宿主细胞不能利用各种可能的C源，有毒化学物质、蛋白毒 素或有毒金属在生长培养基中的存在。对于负选择，这样的基因包括、但不限于：URA3(其 表达在有5_氣乳清酸存在下是致命的）和SacB (其表达在有鹿糖存在下是致命的）。
[0093] 生物催化剂
[0094] 术语"生物催化剂"在本文中用于表示实现底物向产物的化学转化的一级调节剂 化合物，其中所述产物可以是效应物化合物。"生物催化剂"的产生图示在图3,途径A:表 达克隆的DNA片段1，从而产生一级调节剂化合物2,其将底物3转化成效应物化合物4。
[0095] 在许多情况下，所述生物催化剂将是酶，但是，它还可以是酶的复合物、酶和辅因 子的组合、生物催化的RNA分子等。该术语意图涵盖化合物的所有形式，包括蛋白（可能通 过糖、寡糖、多糖或脂肪酸、脂质、类固醇和其它化学取代基和化合物的共价或非共价连接 而修饰）的形式，核酸的形式或几种这样的化合物的组合的形式。通常，生物催化剂的真实 性质可以在使用本发明的方法选择它以后首先进行确立或评估。
[0096] 非常适当地以核酸分子文库的形式提供在本发明的方法中要从其中选择生物催 化剂的潜在生物催化剂群体。这样的核酸分子可以包含比编码生物催化剂本身的信息多得 多的信息。但是，这对于它的可能选择不重要。可以如下产生"文库"：通过用限制性酶消 化得自合适来源生物体的所有DNA，或通过声处理和将片段克隆进载体中，这将导致许多不 同重组载体的产生，每个重组载体具有克隆进它的不同DNA片段。许多不同重组载体的集 合一起形成"文库"。所述文库可以通过技术人员可得到的任意方法产生，例如通过鸟枪法 克隆。"鸟枪法克隆"被称作，使用生物体的全基因组作为克隆的起始点。可替换地，可以 从环境分离DNA/RNA，从而产生数千个不同基因，所述基因可能已经从许多不同生物体衍生 出；这样的核酸材料的集合被称作宏基因组。在所述范围的另一端，可以构建仅含有预期 编码期望的生物催化剂的基因的特定文库，这例如基于DNA同源性、先前的筛选实验或商 购可得的文库。通过鸟枪法克隆技术构建的文库可能含有从数千个（微生物）至数十万个 (高等真核生物或微生物宏基因组）不同的重组质粒，同时仅一个或几个包含目标序列。为 了减小从真核生物衍生出的文库的大小，有时有利的是产生cDNA文库。由于蛋白编码区通 常仅占真核生物的总基因组大小的小百分比，且由于真核细胞通常仅表达它们的基因的子 集，使用逆转录酶生产细胞mRNA的cDNA拷贝及其向cDNA文库中的克隆会产生减小尺寸的 文库，其仅包含生物体的基因组中最感兴趣的部分（表达的蛋白编