观察到菌 落。在24h的温育中，仅含有氯霉素的三个平板中的每一个产生众多菌落，仅含有大观霉素 的平板也是如此。当将I. 3X IO8个细胞铺板时和仅在温育72h以后，才在双重选择系统中 观察到自发抗性，而在单一选择系统中，对于所有细胞密度在短时间范围内观察到自发抗 性。因此，单个突变赋予对一种抗生素的自发抗性的可能性似乎是较大的，而同时双重突变 赋予对两种抗生素的自发抗性的可能性实际上为零。因而，通过使用双重选择系统，由自发 抗性引起的假阳性的水平实际上降低至零。
[0161] 表1. 无生长，" + "单个菌落（1-1000)，"++"汇合的层。每个选择系统一式三 份地执行；X，y, Z:x = 24h生长，y = 48h生长，z = 72h生长。
[0163] 实施例3. EcpGEB05. 1对不同黄嘌呤生物碱的生长应答
[0164] 使用选择测定用不同浓度的基于黄嘌呤的化合物茶碱、黄嘌呤、可可碱和咖啡因， 根据经验确定了 EcpGEB05. 1对4种不同黄嘌呤生物碱的生长应答。
[0165] 程序：将300-400个菌落形成单位铺板在含有氨苄西林（50 μ g/mL)、大观霉素 (80 μ g/mL)、氯霉素（30 μ g/mL)和指定浓度的基于黄嘌呤的化合物（参见表2)的平板上： 预先确定黄嘌呤与适体区域（mCTC8-4适体）的解离常数（K d) (Jenison等人，1994)。无 选择是指不含大观霉素和氯霉素的平板。（+)是指观察到生长。（_)是指没有观察到生长。 (约）是指观察到减少的生长。
[0166] 表2-pGEB05. 1中的核糖开关适体结构域的特异性表征.
[0167]
[0168] 这些结果表明，含有可调节的基因表达构建体（其具有对茶碱特异的核糖开关适 体结构域）的细胞仅在茶碱存在于生长培养基中的选择条件下增殖。
[0169] 考虑到黄嘌呤与茶碱适体区域的解离常数（Kd= 8. 5±0. 40 μ M)，在含有黄嘌呤的 培养基中的生长的缺乏最初是惊人的，但是，如下面讨论的，这归因于黄嘌呤从细胞外环境 至细胞内环境的膜渗透的缺乏。
[0170] 实施例4.针对核糖开关活化基因对宏基因组文库的基于核糖开关的功能选择.
[0171] 57SDbO I (Sommer, Dantas 和 Church, 2009)和 57SDb03 (Sommer 等人，2009)是人 粪便宏基因组DNA文库，AB95D01是土壤宏基因组DNA文库。简而言之，如下制备每个文 库：从上述环境提取DNA，将DNA剪切成l-3kb大小，并将该DNA克隆进pZE21克隆载体 (Lutz和Bujard, 1997 ;不含插入片段的克隆载体）。使用如上所述的方法，制备电感受态 的EcpGEB05. 1细胞。使用如上所述的方法，通过电穿孔将得自三个文库57SDb01、57SDb03 和AB95D01中的每一个的400ng质粒DNA以及作为对照的2ng pZE21转化进电感受态的 EcpGEB05. 1细胞中。在ImL SOC培养基中在37°C恢复1小时以后，将培养物转移至9mL含 有卡那霉素（50 μ g/mL)和氨苄西林（50 μ g/mL)的LB培养基，并在摇动下在37°C培养至 稳定期。对于每个宏基因组文库，将与0. 5-lx IO8个细胞对应的50和100 μ L铺板在含有 氨节西林（50 μ g/mL)、卡那霉素（50 μ g/mL)、氯霉素（30 μ g/mL)、大观霉素（80 μ g/mL)的 LB/琼脂（干燥约2小时）平板上，并在37°C温育69小时。还发现LB/琼脂含有痕量的黄 嘌呤。将没有铺板的剩余培养物在15%甘油溶液中在-80°C保存用于随后筛选。
[0172] 在37 °C保持69小时以后，41个菌落已经出现在用AB95D01文库转化的 EcpGEB05. 1所铺板的平板上，而3个菌落已经出现在用57SDb01文库转化的EcpGEB05. 1 所铺板的平板上。69小时以后零个菌落出现在用对照载体pZE21或57SDb03文库转化的 EcpGEB05. 1细胞所铺板的平板上。为了证实选择的克隆的抗性，将每个菌落重新划线并在 选择性培养基上培养。除了 2个选自57SDb01文库的菌落（其是敏感的，且在证实实验中 不会生长）以外，证实了所有菌株的抗性。
[0173] 将每个菌落接种在含有氨苄西林（50 μ g/ml)和卡那霉素（50 μ g/ml)的LB培 养基中，并在 37°C温育 20h。通过 Sanger 测序（Beckman Coulter, UK)用引物 GEB029/31 将每个选择的菌落的宏基因组插入物双向测序。对于每次读取，修剪低品质评分数据 (〈0.015, >2的含糊核苷酸）以及匹配克隆载体pZE21的序列，并将其排除用于使用CLC DNA Workbench 6.1的进一步分析。用相同软件进行得自每个克隆的每对读取的组装。使用 Blastx，将组装的序列与GenBank非冗余蛋白序列数据库（2013年1月19日）进行对比。 Blastx计算在所有6个框架中翻译的核苷酸查询和在所有6个框架中翻译的非冗余核苷酸 数据库之间的局部序列比对。
[0174] 基于此，假定每个鉴别的开放读码框的功能（参见下表）。序列分析鉴别出35个 携带相同宏基因组插入序列的克隆，所述宏基因组插入序列具有来自编码假定的多药物转 运蛋白的AB95D01文库的起源，所述多药物转运蛋白与来自假单胞菌属种的蛋白具有79% 同一性。发现另一种插入序列编码另一种假定的多药物外排蛋白，其与来自液化沙雷氏菌 (Serratia Iiquefaciens)的蛋白具有99%同一"性。如果多药物输出革El向氯霉素和大观霉 素，它是可以有效地克服双重选择的机制之一，且因此预见到这些结果。
[0175] 表 3.
[0176]
[0177] *双向测序没有覆盖整个插入序列，所以序列是未知的。
[0178] 鉴别出两个与黄嘌呤通透酶（跨细胞膜转运黄嘌呤的酶）具有高相似性（99% ) 的序列。发现一个是在选自AB95D01 土壤文库的克隆中（SEQ ID N0:20)，且发现一个来 自57SDb01粪便文库（SEQ ID N0:21)。如在实施例3中提及的，已经证实黄嘌呤结合茶碱 核糖开关适体（kd= 8. 5±0. 40 μΜ)，但是以前ImM黄嘌呤向生长培养基的添加没有实现 EcpGEB05. 1在选择条件下的生长。据推测，这是由于低程度的EcpGEB05. 1对黄嘌呤的输 入。如上所述，LB培养基（在其中进行选择实验）含有痕量的黄嘌呤。将此与黄嘌呤通透 酶在增殖细胞中的存在偶联，细胞内的黄嘌呤浓度可能升高至活化核糖开关的水平，因而 我们假定这是选择的黄嘌呤通透酶在选择过程中实现生长的机制。
[0179] 为了试验该假设，进行含有和不含黄嘌呤的生长实验。首先，为了消除基因组或 PGEB05. 1测定质粒的任何背景突变的假定贡献，将得自AB95D01 土壤宏基因组文库的编码 假定黄嘌呤通透酶（ρΖΕ21_1Η)的文库质粒提取并重新转化进菌株EcpGEB05. 1中。不是 在LB-培养基中试验该菌株，而是使用不含黄嘌呤的M9基本培养基试验确定的黄嘌呤浓 度的影响。用空克隆载体PZE21转化的菌株EcpGEB05. l(EcpGEB05. 1+ρΖΕ21)用作对照。 将两种菌株接种进3ml补充了 50 μ g/ml的卡那霉素和50 μ g/ml的氨节西林的M9基本培 养基中，并培养过夜。次日，在相同条件下制备新的3ml培养物，并通过从最初培养物转移 30 μ 1进行接种。在指数期（当在600nm的光密度（0D600)已经达到约0. 5时），使用培养 物接种在微量滴定板中的200 μ I M9最低选择性培养基，所述培养基含有不同浓度的黄嘌 呤（下表）。将接种物稀释，使得每种培养物的最初0D600刚好是0.01。将微孔滴定板在 得自Biotek的ELx808吸光度微量滴定平板读数器（ELx808Absorbance Microtiterplate Reader)中在200rpm摇动下在37°C温育。16h后测量0D600,并从每种黄嘌呤浓度的3个生 物副本计算平均值和标准差。当在OmM至ImM范围的黄嘌呤浓度、但是不含氯霉素或大观 霉素培养时，两种菌株未受黄嘌呤的存在影响。当应用选择（30 μ g/ml的氯霉素和80 μ g/ ml的大观霉素）时，仅对于携带含有黄嘌呤通透酶的质粒（ρΖΕ21_1Η)的菌株，和仅当加入 黄嘌呤时（表3)，观察到生长。实验证实了以下预测：DNA插入序列正在编码黄嘌呤通透酶 蛋白，并且增加的黄嘌呤摄取会实现在选择条件下的生长。
[0180] 表3.对不同黄嘌呤浓度的生长应答.
[0182] 本实施例清楚地证实，本文中描述的基因选择系统可以用于从巨大的宏基因组文 库中选择编码转运蛋白酶的基因序列，所述转运蛋白酶用于将效应物化合物（在该实例 中，黄嘌呤）从细胞外空间转运进细胞的细胞质中。
[0183] 应当理解，本发明不限于选择转运蛋白化合物，并且使用如在实施例4中证实的 选择转运蛋白化合物的方法可以选择生物催化剂。
[0184] 简而言之，可以将前体化合物（即要生物转化成期望产物的底物）饲喂给包含可 调节的基因表达构建体（例如PGEB05.1)的感受态细胞系，所述细胞系已经如上所述用宏 基因组文库转化。
[0185] 然后可以对随后在选择条件下增殖的细胞进行选择和测序，以确定其包含编码生 物催化剂的基因序列，所述生物催化剂用于实现前体化合物向核糖开关适体结合化合物 (即期望的生物转化的产物）的转化。
[0186] 然后可以以与如上所述的转运蛋白化合物的验证过程（即在有和没有所述前体 存在下培养细胞，和监测细胞生长）基本上相同的方式，验证所述生物催化剂活性。
[0187] 在本说明书中，除非明确地另外指明，否则词语"或"以当所述条件中的任一个 或两个得到满足时返回真值的算符的含义使用，这不同于要求仅满足条件之一的算符"异 或"。词语"包含"以"包括"的含义使用，而不是以"由……组成"的含义。上面承认的所有 先前教导特此通过引用并入。在本文中对任何先前公开的文件的承认不应当理解为承认或 代表：其教导在本文日期时是澳大利亚或其它地方的普通一般知识。
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