码序列）。cDNA文库构 建是技术人员众所周知的。其它文库类型包括、但不限于如下得到的文库：i)单个亲本基 因的突变（定向突变或随机突变），ii)几个亲本基因的重新组合（诸如通过基因改组产生 的文库），iii)它们的组合。
[0097] "文库"可以是基因的文库或生物体的文库。
[0098] 在所述文库是生物体的文库的情况下，所述宿主可能已经具有期望的生物催化活 性，且本发明的目的是开发改进的生物催化剂。潜在生物催化剂群体可以例如以潜在生物 催化活性的细菌细胞的混合群体（即不同菌株的细胞，例如分离自土壤或水样品）的形式 提供，向所述细胞添加可调节的基因表达构建体，以便选择最佳的菌株。术语"最佳的菌株" 被定义为包含所述可调节的基因表达构建体且可以在生长抑制条件下存活的任何菌株。
[0099] -起形成文库或潜在生物催化剂群体的各个基因可以在质粒或染色体或附加体 DNA上编码。
[0100] -起形成文库或潜在生物催化剂群体的基因可以组成性地表达；或它们可以在可 诱导的表达载体上，在该情况下，它们由于通过各种可能的可操作地连接的调节元件之一 的活化而表达。实际上，没有限制如何和是否诱导生物催化剂表达。表达可以是组成性的， 它可能在已知的或未知的天然调节剂控制下，或它可能是在特别设计的诱导系统控制下的 文库的一部分。无论表达生物催化剂基因的方式如何，优选的是，表达足以允许宿主细胞的 增殖。
[0101] 在上述方面的另一个优选的实施方案中，至少一个微生物宿主细胞可能包含一种 (或多种）编码至少两种潜在生物催化剂的核酸分子，每种潜在生物催化剂能够催化多步 化学转化反应的至少一个反应。优选地，由一种潜在生物催化剂催化的反应的产物是由另 一种潜在生物催化剂催化的反应的底物，其中所述产物中的至少一种是用于切换核糖开关 的效应物化合物。以此方式，可以揭露完整生化途径，并为每个反应步骤选择特定生物催化 剂。在另一个实施方案中，编码不同潜在生物催化剂的核酸分子可以在单独的表达系统中 提供，每个表达系统促进单独潜在生物催化剂的表达。也以此方式，可以提供多步化学转化 反应。
[0102] 宿主生物体本身可以包含或不包含用于催化多步反应的酶和任选的辅因子，在所 述多步反应中，底物被转化成最终的中间体化合物，所述最终的中间体化合物然后被潜在 生物催化剂转化成期望的产物。最终的中间体化合物可以是宿主细胞中的天然中间体，其 通过宿主细胞的天然的可利用的酶或酶集合而产生。可替换地，潜在生物催化剂可以产生 中间体化合物，其可以是或不是用于切换核糖开关的效应物化合物，且其可以转化成在提 供的条件下在宿主生物体中天然地编码和表达（即可利用）的酶的产物。因而，潜在生物 催化剂不需要必然地催化多步反应过程中的最终反应。应当指出，在这样的情况下，存在于 宿主细胞中的有助于形成效应物化合物（其用于在这样的多步系统中切换核糖开关）的酶 系统可以在宿主细胞染色体或附加体DNA (包括可能的质粒DNA，其也编码可调节的基因表 达构建体本身）上编码。因而，除了潜在地催化朝向产物形成的最终反应以外，如本文中定 义的潜在生物催化剂也可以催化多步反应过程的可能反应链中的关键反应，所述关键反应 是寻求的反应，其最终导致（可能经由另外的反应步骤）寻求的产物的产生。
[0103] 因而，宿主生物体可以包含或不包含编码至少两种生物催化剂的一种或多种核酸 分子，每种生物催化剂能够催化多步化学转化反应的至少一个反应。
[0104] 在上述方面的另一个优选的实施方案中，被鉴别为包含生物催化剂的任何宿主细 胞可以通过宿主基因组的基因组工程化获得生物催化活性的增加，或不然。用于基因组工 程化的方法是本领域技术人员已知的，且包括、但不限于多路基因组工程（MGE)、增变株、 化学诱变、基因组改组和基因组合成。
[0105] 在上述方面的另一个优选的实施方案中，可以使用选择方法来鉴别以较高期望产 物浓度存活的一个或多个宿主细胞，使得增加的产物产生水平不会导致宿主细胞的过早死 亡。
[0106] 所述化学转化反应可以是受益于生物催化剂的活化或加速度的任何化学反应。潜 在生物催化剂可以催化的反应类型包括、但不限于由主要酶类别和亚类中的每一种催化的 反应：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。
[0107] 转运蛋白化合物
[0108] 术语"转运蛋白化合物"在本文中用于表示将效应物化合物转运进宿主微生物中 的一级调节剂化合物。"转运蛋白化合物"的产生图示在图3途径B :表达克隆的DNA片段 1，从而产生一级调节剂化合物5,其将效应物化合物4转运进宿主细胞中。
[0109] 在许多情况下，转运蛋白化合物将是酶，但是，它还可以是酶的复合物、酶和辅因 子的组合、RNA分子等。该术语意图涵盖化合物的所有形式，包括蛋白（可能通过糖、寡糖、 多糖或脂肪酸、脂质、类固醇和其它化学取代基和化合物的共价或非共价连接而修饰）的 形式，核酸的形式或几种这样的化合物的组合的形式。通常，转运蛋白化合物的真实性质可 以在使用本发明的方法选择它以后首先进行确立或评估。
[0110] 非常适当地以核酸分子文库的形式提供在本发明的方法中要从其中选择转运蛋 白化合物的潜在转运蛋白化合物群体。这样的核酸分子可以包含比编码转运蛋白化合物本 身的信息多得多的信息。但是，这对于它的可能选择不重要。可以如下产生"文库":通过 用限制性酶消化得自合适来源生物体的所有DNA，或通过声处理和将片段克隆进载体中，这 将导致许多不同重组载体的产生，每个重组载体具有克隆进它的不同DNA片段。许多不同 重组载体的集合一起形成"文库"。所述文库可以通过技术人员可得到的任意方法产生，例 如通过鸟枪法克隆。"鸟枪法克隆"被称作，使用生物体的全基因组作为克隆的起始点。可 替换地，可以从环境分离DNA/RNA，从而产生数千个不同基因，所述基因可能已经从许多不 同生物体衍生出；这样的核酸材料的集合被称作宏基因组。在所述范围的另一端，可以构建 仅含有预期编码期望的转运蛋白化合物的基因的特定文库，这例如基于DNA同源性、先前 的筛选实验或商购可得的文库。通过鸟枪法克隆技术构建的文库可能含有从数千个（微生 物）至数十万个（高等真核生物或微生物宏基因组）不同的重组质粒，同时仅一个或几个 包含目标序列。为了减小从真核生物衍生出的文库的大小，有时有利的是产生cDNA文库。 由于蛋白编码区通常仅占真核生物的总基因组大小的小百分比，且由于真核细胞通常仅表 达它们的基因的子集，使用逆转录酶生产细胞mRNA的cDNA拷贝及其向cDNA文库中的克隆 会产生减小尺寸的文库，其仅包含生物体的基因组中最感兴趣的部分（表达的蛋白编码序 列）。cDNA文库构建是技术人员众所周知的。其它文库类型包括、但不限于如下得到的文 库：i)单个亲本基因的突变（定向突变或随机突变），ii)几个亲本基因的重新组合（诸如 通过基因改组产生的文库），iii)它们的组合。
[0111] "文库"可以是基因的文库或生物体的文库。
[0112] -起形成文库或潜在转运蛋白化合物群体的各个基因可以在质粒或染色体或附 加体DNA上编码。
[0113] -起形成文库或潜在转运蛋白化合物群体的基因可以组成性地表达；或它们可以 在可诱导的表达载体上，在该情况下，它们由于通过各种可能的可操作地连接的调节元件 之一的活化而表达。实际上，没有限制如何和是否诱导转运蛋白化合物表达。表达可以是 组成性的，它可能在已知的或未知的天然调节剂控制下，或它可能是在特别设计的诱导系 统控制下的文库的一部分。无论表达转运蛋白化合物基因的方式如何，优选的是，表达足以 允许宿主细胞的增殖。
[0114] 在上述方面的一个优选的实施方案中，至少一个微生物宿主细胞可能包含一种 (或多种）编码至少两种潜在一级调节剂化合物的核酸分子，其中至少一种一级调节剂化 合物是生物催化剂（如本文中使用的），且至少一种一级调节剂化合物是转运蛋白化合物， 其中由所述生物催化剂催化的反应的底物被所述转运蛋白化合物转运进细胞中。
[0115] 宿主细胞
[0116] 本发明的宿主细胞可以是能够提供潜在一级调节剂化合物群体和调节性基因表 达构建体的必要组分的表达所需的细胞转录和翻译机制的任何宿主细胞。
[0117] 所述宿主细胞可以是、但不限于微生物，诸如原核微生物或真核微生物、植物细胞 或动物细胞系。合适的原核生物包括古细菌和细菌。合适的真核微生物包括酵母细胞、真 菌或原生生物细胞。合适的动物细胞系是例如昆虫细胞系或禽类、爬行动物和鱼类的细胞， 但是也可以使用哺乳动物（包括人）细胞系。
[0118] 底物
[0119] 本文中使用的术语"底物"表示在"生物催化剂"催化的反应中的反应物，即与一级 调节剂化合物的活性部位相互作用、并转化成产物（优选地直接转化成效应物化合物）的 化学化合物。
[0120] 所述底物可以是或不是另一个细胞内生物催化反应或反应系列的产物，其中所述 反应由存在于宿主细胞中的遗传物质编码的生物催化剂执行。
[0121] 为了使加入细胞的外部环境中的底物与潜在生物催化剂接触，所述宿主细胞可以 包含专门的或一般的摄取系统用于跨细胞膜转运底物以便摄入所述底物。但是，这不是必 需的，因为也预见到底物跨细胞膜向细胞内环境中的简单扩散。穿过细胞膜的底物转运依 赖于底物本身的化学性能（例如疏水性、离子特性）和宿主细胞膜的渗透性。应当理解，如 果在某个细胞间隔中产生"生物催化剂"，所述底物可以必须与所述"生物催化剂"直接物理 接触，使得可以发生向产物的转化。
[0122] 在寻求的生物催化剂转化反应中使用的用于制备产物化合物的最初底物通常可 得自商业供应商，或可以通过技术人员已知的方法制备。
[0123] 正选择
[0124] 正选择起作用的一般机制图示在图4中。注：图4仅图示了两种调节序列之一。 呈未结合形式的核糖开关A会掩蔽它的有关的核糖开关结合位点（RBS)6。这不允许编码区 7的表达，因而二级调节剂化合物8不可用于调节生长调节剂化合物9的作用，因此细胞不 能增殖。核糖开关B (其中结合效应物化合物4)经历构象变化，使得RBS被暴露。这允许 RBS结合核糖体和表达编码区7,使得二级调节剂化合物8被表达。二级调节剂化合物8的 表达会调节生长调节剂化合物9的作用，使得它变成非抑制生长的化合物10,且细胞增殖。
[0125] 在一个优选的实施方案中，一种用于根据正选择机制检测一级调节剂化合物的方 法可以基本上如下进行：
[0126] 提供许多微生物宿主细胞，每个宿主细胞包含可以编码一种或多种期望的一级调 节剂化合物的一种或多种DNA片段，且给每个宿主细胞提供如本文中所述的可调节的基因 表达构建体，在该情况下，每个核糖开关是'0N'核糖开关，且每个可操作地连接的编码区编 码赋予抗生素抗性的二级调节剂化合物，其表达会产生能够灭活各种抗生素的酶。
[0127] 将宿主细胞引入生长培养基中，所述生长培养基包含必需生长营养物和两种抗生 素化合物，所述抗生素化合物的水平足以抑制不能表达抗生素抗性基因的细胞的生长。
[0128] 所述生长培养基可以包含试验底物，其可以转化成或其本身可以是可以切换/活 化核糖开关的一种或多种效应物化合物。所述生长培养基可以进一步包含一种或多种诱导 物化合物，其用于开始一种或多种生物催化剂在宿主细胞内的表达（在它们的表达是可诱 导的情况下）。就需要表达而言，一种或多种一级调节剂化合物表达系统的诱导不需要是连 续的，但是也可以是不连续的。
[0129] 表达合适的一级调节剂化合物的细胞将开始克服抗生素生长抑制和增殖，而剩余 细胞的生长将保持被抗生素化合物抑制。
[0130] 生长培养基的组成取决于宿主细胞需求。生长调节剂化合物在生长培养基中的 浓度各自通常在ΙμΜ至IM之间的范围内。技术人员可以容易地确定合