适的浓度。涉及 宿主细胞的方法通常在宿主细胞特异的温度执行，所述温度在微生物的情况下可能是在约 20°C -37°C的范围内。
[0131] 在另一个优选的实施方案中，一种用于根据正选择机制检测一级调节剂化合物的 方法可以如上所述执行，但是所述编码区之一是补充宿主细胞中的营养缺陷型的基因，并 且所述基因的表达会产生二级调节剂化合物，其将生长培养基中的非必需生长化合物转化 成所述营养缺陷型宿主细胞可以利用的必需生长化合物，因而所述宿主细胞增殖。补充宿 主细胞中的这样的营养缺陷型的基因的一个例子是大肠杆菌thrC基因，其编码苏氨酸合 酶。所述酶将〇-磷酸-L-高丝氨酸转化成L-苏氨酸。如果thrC基因没有表达，那么宿主细 胞不会将〇-磷酸-L-高丝氨酸转化成L-苏氨酸，且因而所述细胞即使在有0-磷酸-L-高 丝氨酸存在下也不会增殖。
[0132] 负选择
[0133] 负选择起作用的一般机制图示在图5中。注：图5仅图示了两种调节序列之一。 呈未结合形式的核糖开关A会暴露它的RBS 6,所述RBS 6因此允许表达它的编码区7,以 形成二级调节剂化合物8。二级调节剂化合物8将非细胞毒性化合物10转化成生长调节剂 化合物9,且所述细胞不能增殖。核糖开关B (其中结合效应物化合物4)经历构象变化，使 得RBS 6被掩蔽。这不允许表达编码区7,所述编码区7因此停止二级调节剂化合物8的产 生。在没有二级调节剂化合物8存在下，不抑制生长的化合物10不会被转化成生长调节剂 化合物9,且所述细胞增殖。
[0134] 在一个优选的实施方案中，一种用于根据负选择机制检测一级调节剂化合物的方 法可以基本上如下进行：
[0135] 提供许多微生物宿主细胞，每个宿主细胞包含可以编码一种或多种期望的一级调 节剂化合物的一种或多种DNA片段，且给每个宿主细胞提供如本文中所述的可调节的基因 表达构建体，在该情况下，每个核糖开关是'OFF'核糖开关，且每个可操作地连接的编码区 编码二级调节剂化合物，所述二级调节剂化合物的表达会产生将非细胞毒性化合物转化成 生长调节剂化合物的酶。
[0136] 将宿主细胞引入生长培养基中，所述生长培养基包含必需的生长营养物和非细胞 毒性化合物，所述化合物能够被所述二级调节剂化合物转化成生长调节剂化合物。
[0137] 所述生长培养基可以包含试验底物，其可以转化成或其本身可以是可以切换/活 化核糖开关的一种或多种效应物化合物。所述生长培养基可以进一步包含一种或多种诱导 物化合物，其用于开始一种或多种生物催化剂在宿主细胞内的表达（在它们的表达是可诱 导的情况下）。就需要表达而言，一种或多种一级调节剂化合物表达系统的诱导不需要是连 续的，但是也可以是不连续的。
[0138] 表达合适的一级调节剂化合物的细胞将开始克服由编码区的表达造成的生长抑 制。
[0139] 生长培养基的组成取决于宿主细胞需求。非细胞毒性化合物在生长培养基中的 浓度各自通常在ΙμΜ至IM之间的范围内。技术人员可以容易地确定合适的浓度。涉及 宿主细胞的方法通常在宿主细胞特异的温度执行，所述温度在微生物的情况下可能是在约 20°C -37°C的范围内。
[0140] 正和负选择
[0141] -旦选定一级调节剂化合物，可以将它通过本领域已知的方法分离和任选地纯 化。可替换地，通过本领域已知的转基因方法，将选定的编码一级调节剂化合物的遗传编码 序列引入微生物宿主细胞中，由此产生生产菌株。术语"生产菌株"是指这样的宿主细胞：其 中以高水平产生一级调节剂化合物。所述生产菌株可以在细胞内产生一级调节剂化合物， 或者可以分泌所述一级调节剂化合物，任选地作为融合蛋白。所述一级调节剂化合物可以 从生长培养基分离，任选地在除去细胞以后。另外的加工（诸如一级调节剂化合物的纯化） 可能是必要的。
[0142] 如果所述一级调节剂化合物是生物催化剂，它可以仅仅通过以下用在用于制备期 望的产物的方法中：在合适的反应条件下允许它转化底物。转化通常发生在反应混合物中， 所述反应混合物包含生物催化剂和一种或多种底物，以及如果需要的话，用于生物催化转 化反应的辅因子，任选地在有另外化合物（诸如缓冲剂、螯合剂、离子或还原化合物，其支 持酶的适当构象折叠）存在下。
[0143] 使用渗透化处理过的细胞、休眠细胞、生长中的细胞或这些的组合作为生物催化 剂，可以执行底物向期望产物的生物转化。使用粗制的细胞提取物作为生物催化剂，可以执 行生物转化。可以将生物催化剂固定化在不溶于水的载体或支持系统表面上或内部。所述 生物转化可以在水性介质中执行。它还可以在多相介质中执行，所述多相介质可能包含下 述的两种或更多种：固相、水相、有机相或气相。取决于酶的特征和纯度，允许生物转化反应 进行足够的时间，此后可以从反应混合物回收一种或多种产物和剩余的一种或多种底物和 辅因子。反应条件通常取决于酶反应的最适温度。回收后，通过本领域已知的方法可以进 一步纯化产物、剩余的底物和辅因子。 实施例
[0144] 材料和一般考虑
[0145] 分别使用 QIAprep? Spin Miniprep Kit 和 QIAquick㊣ PCR Purification Kit (购自 Qiagen)，纯化质粒 DNA 和 PCR 产物。使用 GeneJET? Gel Extraction Kit (购 自Fermentas)进行凝胶提取。在本文中使用的咖啡因、茶碱、可可碱、黄嘌呤和所有抗生素 购自Sigma-Aldrich。合成的寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies。下述实施例 利用大肠杆菌DhlOB宿主细胞，且在补充了 0. lg/L亮氨酸和痕量金属的路尼亚肉汤培养基 (LB)或M9基本培养基（本领域已知，且可得自众多供应商）中进行培养实验。将所有菌 株在15% (v/v)甘油溶液中在-80°C保存。如以前所述（Bitinaite和Nichols, 2009,在 本文中以其整体引入），使用USER克隆进行质粒操作。通过DNA测序（由Macrogen，The Netherlands或Beckman Coulter, UK执行的测序），验证构建的所有载体的序列。
[0146] 使用的引物
[0147] 加下划线的序列将被除去，从而在USER克隆过程中产生单链突出端。
[0148]
[0149] 电感受态的大肠杆菌细胞的制备
[0150] 下面概述了用于制备在下述实施例中使用的电感受态细胞的程序：（1)将单个大 肠杆菌菌落接种在IOmL LB培养基中；（2)在摇动下在37°C温育过夜；（3)将0. 5-lmL培养 物转移至250mL新鲜LB培养基；(4)在37°C温育3-4小时（直到OD6。。~0. 4) ; (5)将细胞 在冰/水浴中冷却15分钟；(6)通过离心（5-10分钟，4000rpm，2°C -185-190g总重量/试 管）收集细胞；（7)在水中洗涤2次-通过离心（5-10分钟，4000rpm，2°C -185-190g总重 量/试管）收集细胞；（8)用水补至l_2mL的终体积；（9)将细胞等分在冰冷的印pendorf 试管中（在每个中50/100 μ L)。
[0151] 电感受态的大肠杆菌细胞的电穿孔
[0152] 下面概述了在下述实施例中使用的电感受态大肠杆菌细胞的电穿孔程序：（1)在 电穿孔之前20分钟将比色皿放在冰上；（2)准备具有2mL预温热的SOC培养基的falcon试 管；（3)在冰上融化电感受态的大肠杆菌细胞；（4)将1-2 μ L(彡400ng)DNA加入每个样品 中；（5)将细胞/DNA混合物转移至比色皿；(6)在2. 5kV电穿孔；（7)在电穿孔之后立即将 细胞悬浮于预温热的SOC培养基中；（8)允许在37°C表达表型（在200rpm最小1小时）； (9)将1 μ L经恢复的细胞铺板在含有卡那霉素（50 μ g/mL)和氨苄西林（50 μ g/mL)的LB/ 琼脂平板上以确定转化的成功；（10)将SOC培养基转移至9mL含有卡那霉素（50 μ g/mL)和 氨节西林（50 μ g/mL)的LB液体培养基。在固定相上培养。
[0153] 实施例1.双核糖开关选择载体pGEB05. 1的构建
[0154] pGEB05. 1是基于第二代选择载体pGEB04. 1的第三代选择载体，且pGEB04. 1是基 于第一代选择载体PGEB04。pGEB04包含含有'核糖开关平台'的载体pGEB02。
[0155] PGEB02的构建：构成'核糖开关平台'的221个碱基对的DNA序列（图1)由 Integrated DNA Technologies人工地合成，并在pIDTSMART载体上递送，从而产生 PGEB02。除了核糖开关平台以外，在核糖开关的5'端包括翻转酶识别靶标（Flippase Recognition Target，FRT)序列（5, -GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3'（SEQ ID NO:19))〇
[0156] pGEB04的构建：通过三种PCR产物的环状USER融合，建立pGEB04 :⑴用引 物GEB04/5 (正向/反向）从pGEB02扩增的FRT-核糖开关平台；（2)用引物GEB06/2从 pSKD314(Gallivan，2004)扩增的含有氯霉素酰基转移酶（cat)、pMBl复制起点（ori)和 ampR(氨苄西林选择标志物）的区域；和（3)用引物GEB01/3从pBR322(Sutcliffe，1978) 扩增的tetR(四环素选择标志物）。设计引物，使得三个片段以次序（1)-(2)-(3)在一个 环中无缝融合。引物GEB02和GEB01各自在引物尾巴中包括FRT序列的一部分，使得片段 (2)和⑶的融合在最终的构建体中产生在⑵和（3)之间的完整FRT序列。以此方式， tetR变成侧接2个FRT位点用于通过重组工程（recombineering)实现最终的除去/交换 (Schlake 和 Bode, 1994)。
[0157] pGEB04. 1的构建：通过下述三个片段的环状融合建立pGEB04. 1 :(1)用引物 GEB042/43从pGEB04扩增的核糖开关平台，cat ; (2)用引物GEBO 44/45从pACYC184 (Li和 Tu，1991)扩增的 pl5A ori ;和（3)用引物 GEB046/47 从 pSLY47(Lemire 等人，未公开，细 节可在请求后从申请人得到）扩增的ampR和specR。所述片段以次序（1)-(2)-(3)环状 USER融合。
[0158] pGEB05. 1的构建：通过从pGEB04. 1扩增的两个片段的环状USER融合，建立 PGEB05. 1 :(1)用引物GEB073/74扩增的核糖开关平台（从启动子至起始密码子）；和（2) 用引物GEB077/72扩增的整个pGEB04. 1主链，不包括specR的5' UTR和启动子。（1)和 (2)的融合产生新的载体，其具有另外的核糖开关平台，所述平台直接融合以控制specR表 达（参见图2)。
[0159] 实施例2.在单一和双重选择系统中确定自发抗性
[0160] 使用技术人员已知的标准方法，将pGEB05. 1转化进大肠杆菌DhlOB细胞（形 成EcpGEB05. 1)。为了试验双重选择系统是否解决了自发抗性的问题，在含有大观霉素 (80 μ g/mL)和氯霉素（30 μ g/mL)的LB琼脂培养基上一式10份执行多达I. 3x10s个 EcpGEB05. 1细胞的铺板（'双重选择'）。作为对照，在仅含有氯霉素（30yg/mL)或大观 霉素（80 μ g/mL)的平板上的铺板各自一式三份地执行（'单一选择'）（参见表1)。将每 个平板温育72小时。在进行双重选择的10个平板中，在温育的前48小时内没有