,3.32-3· 37 (m，2H，CH2)， 3. 44-3. 48 (m，2H，CH2)，5. 59 (d，J = 9. 6Hz，1H，CH)，6. 03-6. 09 (m，1H，CH)，6. 16-6. 21 (m， 1H，CH)，7. 21-7. 25 (m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7. 65-7. 67 (m，1H，Ar-H)，7. 71 (t，J = 7. 8Hz， 1H, Ar-H), 7. 88-7. 90 (m, 2H, Ar-H), 7. 96 (s, 1H,嘧啶-H)，8. 14 (d，J = 7. 9Hz，1H， Ar-H)，8.16(s，lH，Ar-H)，8.72(t，J = 5.4Hz，lH，NH)，9.40(s，lH，苯环-NH).LC-MS(m/ z) 551(M+1)〇
[0497] 实施例92
[0498] 3-(3-氰基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
[0499]
[0500] 白色固体3-(3-氰基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（740mg，80. 6%产率）是 由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯（600mg，3. 44mmol)和3-氰基苯甲酰氯（500mg，3. 02mmol) 按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)304(M+l)。
[0501] 实施例93
[0502] N-(3_氨基丙基）_3_氰基苯甲酰胺的制备
[0504] 白色固体N-(3-氨基丙基）-3-氰基苯甲酰胺（300mg，86. 5%产率）是由3-(3-氰 基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（740mg，2.62mmol)按照实施例5中的类似步骤制备 而成。LC-MS(m/z)204(M+l)。
[0505] 实施例94
[0506] N-(3-(2, 5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-3_氰基苯甲酰胺的制备
[0508] 白色固体N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-3-氰基苯甲酰胺（460mg， 89.4%产率）是由2,4,5_三氯嘧啶（360mg，2.21mmol)和N-(3-氨基丙基）-3-氰基苯甲 酰胺（300mg，1.47mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)350(M+l)。
[0509] 实施例95
[0510] N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶基-4-氨基）丙 基）_3_氰基苯甲酰胺的制备
[0512] 白色固体N-(3_(5-氯-2-(4-氟-3_(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶 基-4-氨基）丙基）-3-氰基苯甲酰胺（210mg，31.8%产率）是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶 基_4_氨基）丙基）-3_氰基苯甲酰胺（460mg，1. 31mmol)和N-(5_氨基-2-氟苯基）-N_甲 基丙烯酰胺（280mg，1.44mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMS0-d6) δ 1· 80-1. 86 (m，2H，CH2)，3· 19 (s，3H，CH3)，3· 31-3. 35 (m，2H，CH2)，3· 44-3. 48 (m，2H，CH2)， 5.59(d，J = 10. 2Hz，lH，CH) ,6.03-6. 09 (m，lH，CH)，6. 16-6. 21 (m，lH，CH) ,7.21-7. 26 (m， 2H, Ar-H,嘧啶-NH)，7. 64-7. 66 (m，1H，Ar-H)，7. 68-7. 70 (m，1H，Ar-H)，7. 89-7. 90 (m， 1H，Ar-H)，7. 96(s，1H，嘧啶-Η)，7. 98(d，J = 7. 7Hz，1H，Ar-H)，8. 13(d，J = 7. 9Hz，1H， Ar-H)，8. 24 (s，1H，Ar-H)，8. 66 (t，J = 5. 7Hz，1H，NH)，9. 40 (s，1H，苯环-NH) · LC-MS (m/ z)508(M+l) 〇
[0513] 实施例100
[0514] 3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
[0516] 黄色固体3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（728mg，100% 产率）是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯（348mg，2mmol)和3-氟-4-三氟甲基苯甲酸 (416mg，2mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)365(M+l)。
[0517] 实施例101
[0518] N-(3_氨基丙基）_3_氟_4_二氟甲基苯甲酰胺的制备
[0520] 白色固体N-(3_氨基丙基）-3_氟-4-三氟甲基苯甲酰胺（264mg，50%产率）是由 3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（728mg，2mmol)按照实施例5中 的类似步骤制备而成。LC-MS (m/z) 265 (M+1)。
[0521] 实施例102
[0522] N-(3-(2, 5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-3_氟-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
[0524] 黄色固体N-(3_(2,5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-3_氟-4-三氟甲基苯 甲酰胺（20011^，49%产率）是由2,4,5-三氯嘧啶（18311^，1.00臟〇1)和1(3-氨基丙 基）-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺（264mg，1. OOmmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。 LC-MS(m/z)411(M+l) 〇
[0525] 实施例103
[0526] N- (3- (5-氯-2- (4-氟-3- (N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶基-4-氨基）丙 基）_3_氟-4-二氟甲基苯甲酰胺的制备
[0528] 白色固体N-(3_(5-氯-2-(4-氟-3_(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶 基-4-氨基）丙基）-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺（50mg，20%产率）是由N-(3-(2, 5-二 氯啼陡基-4-氨基）丙基）-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺（205mg，0.5mmol)和N-(5-氨 基-2-氟苯基）-N-甲基丙烯酰胺（110mg，0. 6_〇1)按照实施例7中的类似步骤制备而 成。1!1-匪1?(0150-(16)3 1.8卜1.86(111，2!1，〇12)，3.19(8,3!1，〇13)，3.32-3.36(111，2!1，〇1 2)， 3. 45-3. 47 (m, 2H, CH2), 5. 59 (d, J = 9. 4Hz, 1H, CH), 6. 02-6. 09 (m, 1H, CH), 6. 15-6. 20 (m, 1H，CH)，7. 20-7. 24 (m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7. 64-7. 66 (m，1H，Ar-H)，7. 83-7. 92 (m，4H， Ar-H)，7. 96 (s，1H，嘧啶-H)，8. 75 (t，J = 5. 2Hz，1H，NH)，9. 40 (s，1H，苯环-NH) · LC-MS (m/ z)569(M+l) 〇
[0529] 实施例104
[0530] 3-(2,3,4,5_四氟苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
[0532] 白色固体3_(2,3,4,5_四氟苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（400mg，57. 1% 产率）是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯（348mg，2. OOmmol)和2, 3,4, 5-四氟苯甲酰氯 (848mg，4. OOmmol)按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)351 (M+1)。
[0533] 实施例105
[0534] N- (3-氨基丙基）-2, 3,4, 5-四氟苯甲酰胺的制备
[0536] 白色固体N-(3_氨基丙基）_2,3,4,5_四氟苯甲酰胺（250mg，100%产率）是由 3-(2,3,4,5_四氟苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（350mg，1. OOmmol)按照实施例5中的 类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)251 (M+1)。
[0537] 实施例106
[0538] N-(3_ (2, 5_二氯啼陡基_4_氨基）丙基）_2, 3,4, 5_四氟苯甲酰胺的制备
[0539]
[0540] 白色固体N-(3_(2,5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-2,3,4,5_四氟苯甲酰胺 (200mg，50%产率）是由 2,4,5_ 三氯嘧啶（183mg，1.00mmol)和 N-(3-氨基丙基）-2,3， 4,5_四氟苯甲酰胺（250mg，1.00mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/ z)397(M+l) 〇
[0541] 实施例107
[0542] N- (3- (5-氯-2- (4-氟-3- (N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶基-4-氨基）丙 基）-2,3,4,5_四氟苯甲酰胺的制备
[0544] 白色固体N-(3_(5-氯-2-(4-氟-3_(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶 基-4-氨基）丙基）_2,3,4,5_四氟苯甲酰胺（50mg，18%产率）是由N-(3-(2,5-二 氣啼陡基-4-氛基）丙基）_2, 3,4, 5_四氣苯甲醜胺（200mg，0. 5mmol)和N- (5_氛 基-2-氟苯基）-N-甲基丙烯酰胺（110mg，0. 6_〇1)按照实施例7中的类似步骤制备而 成。1H-NMR(DMS0-d6) δ 1.79-1. 82 (m，2H，CH2)，3.19 (s，3H，CH3) ,3.28-3· 30 (m，2H，CH2)， 3. 44-3. 46 (m，2H，CH2)，5. 60 (d，J = 9. 8Hz，1H，CH)，6. 03-6. 09 (m，1H，CH)，6. 16-6. 21 (m，1H， CH)，7. 23-7. 27 (m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7. 56-7. 61 (m，1H，Ar-H)，7. 65-7. 67 (m，1H，Ar-H)， 7. 88(d，J = 5. 4Hz，lH，Ar-H)，7. 95(s，1H，嘧啶-Η)，8. 52(s，1H，NH)，9. 40(s，1H，苯环-NH). LC-MS(m/z)555(M+l) 〇
[0545] 实施例108
[0546] 3-(4-乙酰基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
[0548] 白色固体3-(4-乙酰基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（385mg，60.2%产 率）是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯（350mg，2. Olmmol)和4-乙酰基苯甲酸（328mg， 2. OOmmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)321 (M+1)。
[0549] 实施例109
[0550] 4-乙酰基-N-(3-氨基丙基）苯甲酰胺的制备
[0552] 白色固体4-乙酰基-N_(3-氨基丙基）苯甲酰胺（200mg，75.8%产率）是由 3-(4-乙酰基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（385mg，1. 20mmol)按照实施例5中的类似 步骤制备而成。LC-MS(m/z)221 (M+1)。
[0553] 实施例110
[0554] 4-乙酰基-N-(3-(2, 5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）苯甲酰胺的制备
[0556] 白色固体4-乙酰基-N-(3-(2, 5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）苯甲酰胺（120mg， 36.1%产率）是由2,4,5-三氯嘧啶（18〇11^，0.98臟〇1)和4-乙酰基4-(3-氨基丙基）苯 甲酰胺（200mg，0. 91mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)367(M+l)。
[0557] 实施例111
[0558] 4-乙酰基-N-(3_(5-氯-2-(4-氟-3_(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶 基-4-氨基）丙基）苯甲酰胺的制备
[0560] 白色固体4-乙酰基-N- (3- (5-氯-2- (4-氟-3- (N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基） 嘧啶基-4-氨基）丙基）苯甲酰胺（83mg，47.9%产率）是由4-乙酰基-N-(3-(2,5-二氯 嘧啶基-4-氨基）丙基）苯甲酰胺（120mg，0.33mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基）-N-甲 基丙烯酰胺（70mg，0. 36mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMS0-d6) δ 1. 79-1. 85 (m，2H，CH2)，2. 61 (s，3H，CH3)，3. 19 (s，3H，CH3)，3. 32-3. 36 (m，2H，CH2)， 3. 45-3. 48 (m，2H，CH2)，5. 59 (d，J = 9. 9Hz，1H，CH)，6. 02-6. 09 (m，1H，CH)，6. 15-6. 20 (m，1H， CH)，7. 21-7. 28 (m，2H，嘧啶-NH，Ar-H)，7. 64-7. 69 (m，1H，Ar-H)，7. 88-7. 89 (m，1H，Ar-H)， 7. 94(d，J = 8. 3Hz，2H，Ar-H)，7. 96(s，1H，嘧啶-Η)，8. 01(d，J = 8. 4Hz，2H，Ar-H)，8. 65(t， J = 5. 3Hz，1H，NH)，9. 40(s，1H，苯环-NH). LC-MS(m/z)525(M+l)。
[0561] 实施例112
[0562] 3-(4-二氟甲基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
[0564] 白色固体3-(4-二氟甲基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（780mg，84. 3%产 率）是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯（490mg，2. 82mmol)和4-二氟甲基苯甲酸（485mg， 2. 82mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)329(M+l)。
[0565] 实施例113
[0566] N- (3-氨基丙基）-4-二氟甲基苯甲酰胺的制备
[0568] 白色固体N-(3_氨基丙基）-4_二氟甲基苯甲酰胺（180mg，33.2%产率）是由 3-(4-二氟甲基苯甲酰胺基）丙基氨基甲酸叔丁酯（780mg，2. 38mmol)按照实施例5中的类 似步骤制备而成。LC-MS (m/z) 229 (M+1)。
[0569] 实施例114
[0570] N-(3-(2, 5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-4_二氟甲基苯甲酰胺的制备
[0572] 白色固体N-(3_(2,5-二氯嘧啶基-4-氨基）丙基）-4_二氟甲基苯甲酰胺（250mg， 84.5%产率）是由2,4,5-三氯嘧啶（18011^，0.98臟〇1)和1(3-氨基丙基）-4-二氟甲基 苯甲酰胺（180mg，0. 79mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)375(M+l)。
[0573] 实施例115
[0574] N- (3- (5-氯-2- (4-氟-3- (N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶基-4-氨基）丙 基）-4-二氟甲基苯甲酰胺的制备
[0576] 白色固体N-(3_(5-氯-2-(4-氟-3_(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧 啶基-4-氨基）丙基）-4-二氟甲基苯甲酰胺（26mg，23. 2 %产率）是由N-(3-(2， 5-二氯啼陡基-4-氨基）丙基）-4-二氟甲基苯甲酰胺（80mg，0. 21mmol)和N-(5-氨 基-2-氟苯基）-N-甲基丙烯酰胺（50mg，0.26mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而 成。1!1-匪1?(0150-(16)3 1.8卜1.84(111，2!1，〇12)，3.19(8,3!1，〇13)，3.32-3.40(111，2!1，〇1 2)， 3. 45-3. 47 (m, 2H, CH2), 5. 59 (d, J = 9. 4Hz, 1H, CH), 6. 03-6. 09 (m, 1H, CH), 6. 16-6. 20 (m, 1H, CH), 6. 94 (s, 0. 4H, CHF2), 7. 08 (s, 0. 6H, CHF2), 7. 22-7. 26 (m, 2H, Ar-H,嘧啶 _NH)， 7. 64-7. 66 (m, 3H, Ar-H), 7. 89-7. 90 (m, 1H, Ar-H), 7. 95 (d, J = 7. 3Hz, 2H, Ar-H), 7. 96 (s, 1H，嘧啶-H)，8. 59 (s，1H，NH)，9. 40 (s，1H，苯环-NH) · LC-MS (m/z) 533 (M+l)。
[0577] 实施例120
[0578] 6-(4-氰基苯甲酰胺基）己基氨基甲酸叔丁酯的制备
[0580] 白色固体6-(4-氰基苯甲酰胺基）己基氨基甲酸叔丁酯（1300mg，73. 4%产率）是 由6-己基氨基甲酸叔丁酯（1100mg，5. 09mmol)和4-氰基苯甲酰氯（900mg，5. 45mmol)按 照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS (m/z) 346 (M+1)。
[0581] 实施例121
[0582] N-(6-氨基己基）-4_氰基苯甲酰胺的制备
[0584] 白色固体N-(6_氨基己基）-4_氰基苯甲酰胺（700mg，75. 6%产率）是由6-(4-氰 基苯甲酰胺基）己基氨基甲酸叔丁酯（1300mg，3. 76mmol)按照实施例5中的类似步骤制备 而成。LC-MS (m/z) 246 (M+1)。
[0585] 实施例122
[0586] 4-氰基-N-(6-(2, 5-二氯嘧啶基-4-氨基）己基）苯甲酰胺的制备
[0588] 白色固体4-氰基-N-(6_(2,5-二氯啼陡基-4-氨基）己基）苯甲酰胺（80mg， 49.7%产率）是由2,4,5-三氯嘧啶（12011^，0.66臟〇1)和1(6-氨基己基）-4-氰基苯甲 酰胺（100mg，0. 41mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)392(M+l)。
[0589] 实施例123
[0590] N- (6- (5-氯-2- (4-氟-3- (N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶基-4-氨基）己 基）_4_氰基苯甲酰胺的制备
[0592] 白色固体N-(6_(5-氯-2-(4-氟-3_(N-甲基丙烯酰胺基）苯基氨基）嘧啶 基-4-氨基）己基）-4-氰基苯甲酰胺（47mg，50.3%产率）是由4-氰基-N-(6-(2,5-二 氯啼陡基-4-氨基）己基）苯甲酰胺（68mg，0. 17mmol)和N-(5_氨基-2-氟苯基）-N_甲 基丙烯酰胺（46mg，0. 24mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMS0-d6) δ 1. 30-1. 32(m，4H，2XCH2)，1. 52-1. 56(m，4H，2XCH2)，3· 19(s，3H，CH3)，3· 26-3. 29(m， 2H，CH2)，3· 36-3. 37(m，2H，CH2)，5· 60(d，J = 9. 9Hz，1H，CH)，6· 03-6. 10(m，1H，CH)， 6. 17-6. 21 (m，1H，CH)，7. 22-7. 27 (m，2H，嘧啶-NH，Ar_H)，7. 59-7. 61 (m，1H，Ar_H)， 7. 93-7. 98(m，6H，嘧啶-NH，Ar-H)，8. 64(s，1H，NH)，9. 38(s，1H，苯环-NH) · LC-MS(m/ z)550(M+l) 〇
[0593] 体外生物学评价
[0594] 本检测方法用于本发明所述化合物的体外活性评价，包括体外酶学活性评价方 法、细胞生长活性评价方法以及细胞内活性评价方法。
[0595] 本检测的目的在于综合评价不同化合物对JAK、ITK、BLK、TBK1及VEGFR等激酶的 体外酶学抑制活性特点、亚型选择性特征以及对细胞模型的生物学活性影响，包括细胞生 长活性以及信号通路调节活性。
[0596] 实施例A酶学活性检测
[0597] 实骑丰要原理
[0598] 体外酶学活性检测的基本原理是利用荧光标记的特异性底物，在激酶作用下进 行磷酸化，磷酸化底物和非磷酸化底物在不同波长会产生强弱不同的荧光信号（445nm与 520nm)。当加入不同测试化合物时，其对激酶活性的抑制体现为底物磷酸化的程度，从而表 现出不同的荧光信号，并以此计算化合物对激酶的抑制活性。基本的检测原理如附图1所 /_J、1 〇
[0599] 酶学抑制活性检测利用GST标记的人重组JAKs激酶JAK1/PV4774、JAK2/ PV4210、JAK3/PV3855、TYK2/PV4790 及其相应的特异性底物 Tyr6(Z ' - LYTF彩 Kinase Assay Kit-Tyrosine6Peptide, JAK1/PV4122) > Tyr4 (Z ' - LYTi·'% Kinase Assay Kit-Tyrosine4Peptide, JAK2/PV3193) > Tyr4 (Z ' - L.YTH:R：: Kinase Assay Kit-Tyrosine4Peptide, JAK3/PV3193)> Tyr3(Z ' - LYTE# Kinase Assay Kit_Tyrosine4Peptide，TYK2/PV3192)。检测试剂均为显色剂 A (Development reagent A, PV3297)。上述所有材料均从Invitrogen公司购买。
[0600] 实骀丰要讨稈
[0601] 实验过程按照检测试剂使用说明书要求的流程进行（Invitrogen)。流程如下：
[0602] (1)实验准备：按照要求配制激酶反应缓冲液（工作液），用激酶反应缓冲液将测 试化合物稀释成不同浓度梯度（对JAK1、JAK2、TYK2检测，化合物最高浓度均为10 μ Μ ;对 JAK3检测，化合物最高浓度为1 μ Μ)。
[0603] (2)酶学反应体系10yL，包含2. 5yL测试化合物、5yL激酶反应缓冲液和 2. 5 μ LATP溶液（试剂盒提供），混匀后，室温反应1小时。
[0604] (3)检测反应同时设置有对照反应，包括未添加测试化合物的溶剂对照、未添加 ΑΤΡ的阴性对照以及添加磷酸化底物的阳性对照。所有检测重复3次。
[0605] (4)酶学反应结束后，加入5 μ L预先配制的显色反应缓冲液，室温反应1小时。随 后加入5 μ L终止缓冲液终止反应。
[0606] (5)使用突光检测仪（Ascent Fluoroskan FL reader，Thermo Labsystems)检测 每孔的荧光信号，激发波长为400nm，检测的发射波长分别为445nm和520nm。底物磷酸化 的比例参照荧光信号强度C445/F520。
[0607] (6)测试化合物的酶学抑制率计算公式：抑制率（％)= 1-检测孔底物磷酸化/ 溶剂对照孔磷酸化率。对不同浓度梯度的测试化合物分别计算出磷酸化抑制率后利用IC5。 计算器计算酶学半抑制浓度（IC5。)。
[0608] 根据上述实验方法，以Xeljanz (枸橼酸托法替尼）为阳性对照化合物，将本发明 所述化合物进行体外JAKs酶学评价（对JAK3和JAK2检测，测试化合物浓度为30nM ;对 JAK1检测，测试化合物浓度为300nM)。数据小结见下表（表2)。
[0609] 表2本发明代表性化合物抑制JAKs的酶学数据
[0612] aRV =测试化合物/Xel janz的抑制率比值；ND (没有数据）
[0613] 上表数据表明：与阳性对照药相比，本发明化合物具有选择性JAK3和/或JAK1激 酶抑制活性。
[0614] 选择本发明所述部分化合物委托Eurofins公司（http ://www. eurofins. com)进行 激酶谱筛选（KinaseProfiler?)和酶学抑制活性（ICMPr〇filer TM)测定。完成活性筛选的激 酶中除了 JAK家族激酶外，还包括多数Group 3F和Group 4激酶（ITK、BLK、TBKl、VEGFRs、 ERBBs 等）以及血液系统相关激酶（Zhang J.，et al. 2009, Nat. Rev. Cancer.，9 :28-39)。 测试化合物进行激酶谱筛选的浓度为1 μ M，IC5。测定采用9个半对数浓度梯度。实验检测 按照Eurofins公司的标准实验流程开展。实验方法如下：根据不同激酶的反应要求，0.2yL 测试化合物（50 μ Μ溶于二甲基亚砜DMS0)加入含有特定激酶的反应缓冲液（根据激酶类 型不同，缓冲体系分别包含：20mM M0PS，lmM EDTA，0. 01% Brij-35,5% Glycerol，0. 1% i3-mercaptoethanol，lmg/mL BSA 或 50mM TRIS，0.1mM EGTA，0.1mM Na3V04,0.1% β-疏 基乙醇，lmg/mL BSA)，随后依次加入终浓度为50 μ M的激酶特异性底物（不同激酶采用 不同底物）、10mM MgAcetate和同位素标记的γ -33P ATP (放射活性约500cpm/pmol)，反 应体系总体积为10 μ L。室温孵育40分钟，以3%磷酸终止反应，随后转入滤网式低温喷 雾干燥设备（P30filtermat)，以75mM磷酸清洗三次和甲醇清洗一次，干燥后进行放射活性 检测。具体操作流程参见Eurofins公司提供的标准操作流程：http ：//www. eurofins. com/ media/9724077/kinaseprof