[0079] 四、将ssrl_l:SSR和ssrl-2 :SSR在MS固体培养基上培养，根的形态分别如图2A 中ssrl-1 :SSR和图2C中ssrl-2 :SSR所示，结果表明，ssrl-Ι和ssrl-2的根短表型通过 转入SSR基因组序列得到恢复。
[0080] 将空载体PCAMBIA1300进行上述步骤三得到转入空载体的ssrl-Ι和转入空载体 的ssrl-2对照植株，两个对照植株在MS固体培养基上培养后，根的表型与ssrl-l、ssrl-2 的根的表型一致，根显著短于野生型拟南芥。
[0081] 五、将Col、ssrl-Ι和ssrl-1 :SSR在含有200mM甘露醇的MS培养基上培养，根生 长如图2B所示。
[0082] 图2B表明，与野生型拟南芥Col相比，SSR基因部分缺失后对甘露醇胁迫（干旱 胁迫）根生长表现出敏感表型，根显著短于野生型拟南芥Col，而SSR基因回补后，拟南芥的 根长得到恢复，与野生型拟南芥的根长无显著性差异。
[0083] 六、将Ws和ssrl-2在MS培养基上培养，根部细胞如图2D所示。
[0084] 图2D表明，与野生型拟南芥Ws相比，ssrl-2的根部细胞膨大。
[0085] 实施例5、SSR基因敲除对根生长点处细胞分裂分化状态的影响
[0086] QC25和wox5是监测植物根静止中心细胞状态的marker基因，将其标记可用于根 静止中心细胞的活性的检测，由于根的静止中心活性直接影响到根的生长，所以QC25和 wox5也可以反应根的生长状态。
[0087] 一、将突变体ssrl-2分别和带有QC25:⑶S标签和wox5 :GFP标签的转基因拟南芥 杂交，分别得到敲除SSR基因的含有QC25:⑶S标签的F2代植株或者敲除SSR基因的含有 wox5 :GFP标签的F2代植株。
[0088] 同时将拟南芥Col-Ο生态型分别和带有QC25:⑶S标签和wox5 :GFP标签的转基因 拟南芥杂交，分别得到未敲除SSR基因的含有QC25:GUS标签的F2代植株或者未敲除SSR 基因的含有wox5 :GFP标签的F2代植株。
[0089] 二、对未敲除SSR基因的含有QC25:⑶S标签的F2代植株（转QC25:⑶S的WT)和 敲除SSR基因的含有QC25:⑶S标签的F2代植株（转QC25:⑶S的ssr1-2)进行⑶S染色， 两种植株中的QC25的表达结果分别如图3中A和B所示。
[0090] 对未敲除SSR基因的含有wox5 :GFP标签的F2代植株（转wox5 :GFP的WT)和敲 除SSR基因的含有wox5 :GFP标签的F2代植株（转wox5 :GFP的ssrl-2)的进行荧光检测， 两种植株中的wox5的表达结果分别如图3中C和D所示。
[0091] 图3表明，SSR基因敲除减弱了QC的活性，表现为QC25表达减弱，而wox5的表达 范围变大。实验证明，与野生型拟南芥相比，SSR基因敲除拟南芥分生区细胞的分裂能力减 弱。
[0092] 实施例6、SSR基因敲除对根发育相关基因的影响
[0093] 将突变体ssrl-2 分别和带有PLTlpro:CFP、PLT2pro:CFP、PLTlpra:PLTl:YFP、 PLT2pro:PLT2:YFP标签的转基因拟南芥杂交，分别得到敲除SSR基因的并且含有 PLTlpro:CFP、PLT2pro:CFP、PLTlpro:PLTl:YFP或PLT2pra:PLT2:YFP标签的F2 代植株。
[0094] 同时将拟南芥Col-Ο生态型分别和带有PLTlpro:CFP、PLT2pra:CFP、 PLTlpro:PLT1:YFP、PLT2pro:PLT2:YFP标签的转基因植株杂交，分别得到未敲除SSR基因的 并且含有PLTlpro:CFP、PLT2pro:CFP、PLTlpro:PLTl:YFP或PLT2pro:PLT2:YFP标签的F2 代植 株。
[0095] 未敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:CFP的F2代植株（转PLTlpra:CFP的WT)的PLT1基因的RNA表达检测结果如图4中A所示。
[0096] 敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:CFP的F2代植株（转PLTlpro:CFP的ssrl-2)的 PLT1基因的RNA表达检测结果如图4中B所示。
[0097] 未敲除SSR基因的并且含有PLT2pro:CFP的F2代植株（转PLT2pra:CFP的WT)的PLT2基因的RNA表达检测结果如图4中C所示。
[0098] 敲除SSR基因的并且含有PLT2pr。:CFP的F2代植株（转PLT2pr。:CFP的ssr1-2)的 PLT2基因的RNA表达检测结果如图4中D所示。
[0099] 未敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:PLT1:YFP的F2代植株（转PLTlpra:PLT1:YFP 的WT)的PLT1蛋白表达检测结果如图4中E所示。
[0100] 敲除SSR基因的并且含有PLTlpro:PLT1:YFP的F2代植株（转PLTlpra:PLT1:YFP的 ssrl-2)的PLT1蛋白表达检测结果如图4中F所示。
[0101] 未敲除SSR基因的并且含有PLT2pro:PLT2:YFP的F2代植株（转PLT2pra:PLT2:YFP 的WT)的PLT2蛋白表达检测结果如图4中G所示。
[0102] 敲除SSR基因的并且含有PLT2pro:PLT2:YFP的F2代植株（转PLT2pra:PLT2:YFP的 ssrl-2)的PLT2蛋白表达检测结果如图4中Η所示。
[0103] 图4中A、B、C和D表明，SSR基因敲除后，PLT基因的RNA表达水平没有变化。图 4中E、F、G和Η表明，SSR基因敲除导致PLT蛋白表达水平降低，表明根部分生区细胞的分 化能力减弱。
[0104] 实施例7、SSR基因敲除对生长素运输的影响
[0105] DR5是生长素响应基因，将其标记可用于生长素分布的检测。
[0106] 一、将拟南芥Col-Ο生态型和突变体ssrl-2分别与带有生长素标记DR5rev:GFP 的转基因植株杂交，分别得到未敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP标签的F2代植株以（转 DR5rev:GFP的WT)及敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP标签的F2代植株（转DR5rev:GFP 的ssrl-2)〇
[0107] 未敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP标签的F2代植株（转DR5rev:GFP的WT)的 DR5基因的表达检测结果如图5中A所示。
[0108] 敲除SSR基因的含有DR5rev:GFP标签的F2代植株（转DR5rev:GFP的ssrl-2) 的DR5基因的表达检测结果如图5中B所示。
[0109] 与转DR5rev:GFP的WT相比，转DR5rev:GFP的ssrl-2的根部生长素浓度和梯度 分布发生变化，具体为DR5基因在根尖处表达降低，说明生长素分布减少，同时静止中心 细胞（QC)处不再是DR5基因表达最高的地方，说明生长素浓度梯度分布也发生了变化。
[0110] 二、将突变体ssrl-2和拟南芥Col-ο生态型分别与带有PINlpro:PINl:GFP 的转基因拟南芥杂交，得到F2代植株，分别为转PINlpro:ΡΙΝΙ:GFP的ssr1-2和转 PINlpro:PINl:GFP的WT。
[0111] 将突变体ssr1-2和拟南芥Col-ο生态型分别与带有PIN2pro:PIN2:GFP的 转基因拟南芥杂交，得到F2代植株，分别为转PIN2pro:PIN2:GFP的ssr1-2和转 PIN2pro:PIN2:GFP的WT。
[0112] 将突变体ssrl-2和拟南芥Col-Ο生态型分别与带有PIN3pro:PIN3:GFP的 转基因拟南芥杂交，得到F2代植株，分别为转PIN3pr〇:PIN3:GFP的ssrl-2和转 PIN3pro:PIN3:GFP的WT。
[0113] 将突变体ssr1-2和拟南芥Col-Ο生态型分别与带有PIMpro:PIN4:GFP的 转基因拟南芥杂交，得到F2代植株，分别为转PIN4pr〇:PIN4:GFP的ssrl-2和转 PIMpro:PIN4:GFP的WT。
[0114] 将突变体ssrl-2和拟南芥Col-Ο生态型分别与带有PIN7pro:PIN7:GFP的 转基因拟南芥杂交，得到F2代植株，分别为转PIN7pro:PIN7:GFP的ssr1-2和转 PIN7pro:PIN7:GFP的WT。
[0115] 各植株的PIN蛋白表达测结果如图6所示。
[0116] 图6表明，和野生型拟南芥相比，SSR基因敲除突变体中生长素载体运输蛋白的表 达量都降低，表明生长素运输受到了阻碍。
[0117]五、转PIN2pro:PIN2:GFP的ssrl-2和转PIN2pro:PIN2:GFP的WT的PIN2蛋白表 达检测结果如图7所示。
[0118]图7中，左图为转PIN2pro:PIN2:GFP的WT，右图为转PIN2pro:PIN2:GFP的 ssrl_2〇
[0119] 图7表明，SSR基因敲除直接影响了PIN2蛋白的亚细胞定位，使PIN2蛋白（如图 7中箭头所示）大部分定位在细胞质中。而在野生型拟南芥中，PIN2蛋白绝大部分定位在 细胞膜上。SSR基因敲除后，PIN2蛋白无法正常定位在行使功能的细胞膜上，说明SSR基因 突变体中PIN2蛋白功能缺失，从而导致生长素在突变体中运输受阻。
【主权项】
1. 一种抑制植物的根生长的方法，是敲除植物中的SSR基因。2. -种促进植物的根生长的方法，是使SSR基因在植物中过表达。3. -种抑制植物中生长素运输的方法，是敲除植物中的SSR基因。4. 一种降低植物抗旱能力的方法，是敲除植物中的SSR基因。5. -种提高植物抗旱能力的方法，是使SSR基因在植物中过表达。6. 根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于：所述使SSR基因在植物中过表达的 方法是将含有所述SSR基因的重组表达载体导入所述植物中。7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述植物为拟南芥； 所述SSR基因为拟南芥的SSR基因。 8. SSR基因在促进植物的根生长或提高植物的抗旱能力中的应用。 9. SSR基因作为靶点在抑制植物的根生长、抑制植物中生长素运输或降低植物的抗旱 能力中的应用。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥； 所述SSR基因为拟南芥的SSR基因。
【专利摘要】本发明公开了一种SSR基因在调控植物根生长发育和生长素运输中的应用。本发明公开一种抑制植物的根生长的方法，是敲除植物中的SSR基因。本发明证明拟南芥SSR基因在植物的根生长及生长素运输中发挥了重要作用。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105463010
【申请号】CN201410451829
【发明人】华学军, 张敏
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月5日