ES缓冲液（50mM HEPES，100mM NaCl，0.1%BSA，0.05% CHAPS，pH7.5)用于制备BRD4(BD2)蛋白、Biot in标记的组蛋白H4、待测化合物（DMSO 0.1 % )、donorbeads和acceptor beads溶液。取384孔板一块，按照布置，板上分待测化合物 孔、空白对照孔(min，max)、阳性药对照孔。向待测化合物孔和阳性药孔分别加入不同浓度 的化合物溶液5yL，空白加入缓冲液5yL(DMS0 0.1 % )。继续向除空白对照孔(min)外的各孔 加入BRD4(BD2)蛋白溶液5yL，向空白对照孔(min)加入缓冲液5yL。室温下孵育15分钟后，每 孔加入Biot in标记的组蛋白H4溶液5yL，继续在室温下孵育1小时后，加入donor beads和 acceptor beads溶液15yL，避光室温孵育1小时后用EnSpire检测仪的Alpha mode(Aex = 680，Xem = 570)读取荧光数值。
[0094]数值处理：抑制率=(Max-Signal)/(Max_Min) X 100%
[0095] 其中:Max:Biotin标记的组蛋白H4与蛋白完全结合的值 [0096] Min: Biot in标记的组蛋白H4本底值 [0097] Signal:化合物相应浓度下的值
[0098]以化合物浓度和相应的抑制率做S曲线。得到相应化合物的IC50。
[0099] 以下表1为本发明制备实施例中的化合物在药理实验实施例1中得到的生物活性 结果。
[0100] 表1
[0102] 注："NT"表示没有测试IC50。
[0103]表1所列的部分化合物初筛浓度为ΙμΜ下表现出与阳性对照( + )_JQ1相当的抑制 率，部分化合物IC5Q与⑴-JQl相当，显示出较强的活性，表明本发明的化合物在酶水平可以 有效结合具有bromodomian结构域的蛋白，因此本发明的化合物可以成为抗肿瘤的有效药 物。
[0104] 药理活性实施例2:化合物细胞水平活性测定
[0105] 化合物细胞水平的活性检测采用Celltiter-Glo荧光细胞活力检测法。将处于对 数生长期的MV4-11细胞接种至96孔培养板，培养过夜后，加入待测化合物37°C，5 % CO2孵育 72h，结束后，检测前30分钟在室温下平衡测定试剂。每孔加入30uL CelItiter-Glo试剂，摇 晃96孔板10分钟诱导细胞裂解。将96孔板在室温下孵育2分钟来稳定荧光信号。使用 Envision检测仪来读取荧光数值。
[0106] 数值处理：抑制率= (Max signal-Compound signal)/(Max signal-Min signal) X100%
[0107] 其中:Max signal :DMS0作用中读取到的最大值
[0108] Min signal:只有介质作用的最小值
[0109] Compound signal:化合物相应浓度下的值
[0110]以化合物浓度和相应的抑制率做S曲线。得到相应化合物的IC50。
[0111]以下表2为本发明制备实施例中部分化合物在药理实施例2中得到的生物活性结 果。
[0112]表2
[0114]表2所列化合物的IC5q数值，表明本发明的化合物在细胞水平可以有效结合具有 bromodomaiη结构域的蛋白，因此本发明的化合物可以成为肿瘤的有效治疗药物。
【主权项】
1. 一种通式(I)所示的Ξ氮挫类化合物及其可药用的盐：其中： 化独立选自氨原子、1-6碳的烷基； R2独立选自氣取代苯基、氯取代苯基、1-6碳的烷基取代苯基、1-6碳的烷氧基取代苯基、 Ξ氣甲基取代苯基、1-6碳的烷基簇酸、1-6碳的烷基簇酸醋、1-6碳的烷基酷胺、1-6碳的締 控簇酸或者1-6碳的締控簇酸醋； η为1至6的整数。2. 根据权利要求1所述的化合物及其可药用的盐，其中： 化独立选自氨原子、1-3碳的烷基； R2独立选自氣取代苯基、氯取代苯基、1-3碳的烷基取代苯基、1-3碳的烷氧基取代苯基、 Ξ氣甲基取代苯基、1-3碳的烷基簇酸、1-3碳的烷基簇酸醋、1-3碳的烷基酷胺、1-3碳的締 控簇酸或者1-3碳的締控簇酸醋； η为1至4的整数。3. 根据权利要求2所述的化合物及其可药用的盐，其中： 化独立选自氨原子、甲基； R2独立选自氣取代苯基、氯取代苯基、甲基取代苯基、甲氧基取代苯基、Ξ氣甲基取代苯 基、乙酸基、乙酸甲醋、乙酷化咯； η为1至2的整数。4. 根据权利要求1-3中所述的化合物及其可药用的盐，其中，所述化合物为下列化合物 之一或其可药用盐： 6-( 3，5-二甲基异恶挫)-4-苯基-3-( (1-苯基-1Η-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3，4-二氨哇挫 嘟酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(4-甲氧基苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3， 4-二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(3-甲氧基苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3， 4-二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(3-甲氧基苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3， 4-二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(3-氣苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3，4-二 氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(2-氣苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3，4-二 氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(4-氣苯基)-3-( (1-苯基-lH-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3，4-二 氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫）-4-(2，4-二氣苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)-3， 4-二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3,5-二甲基异恶挫）-4-(3-甲基苯基)-3-((1-苯基-1Η-1，2,3-Ξ氮挫）甲基)-3,4- 二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3，5-二甲基异恶挫)-4-(4-Ξ氣甲基苯基)-3-( (1-苯基-1H-1，2，3-Ξ氮挫）甲基)- 3.4- 二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3,5-二甲基异恶挫)-4-(3-Ξ氣甲基苯基)-3-((1-苯基-1Η-1，2,3-Ξ氮挫）甲基)- 3.4- 二氨哇挫嘟-2 (1Η)-酬； 6-(3,5-二甲基异恶挫)-4-(2-Ξ氣甲基苯基)-3-((1-苯基-1Η-1，2,3-Ξ氮挫）甲基)- 3.4- 二氨哇挫嘟-2 (1Η)-酬； 6-(3,5-二甲基异恶挫）-1-甲基-4-苯基-3-((1-苯基-1Η-1，2,3-Ξ氮挫）甲基)-3,4- 二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬； 6-(3,5-二甲基异嗯挫-4-基)-3-( (1-(2-氧代-2-川比咯烷基-1-基)-乙基)-1H-1，2,3- =氮挫-4-基）甲基-4-苯基-3，4-二氨哇挫嘟-2 (1H)-酬。5.权利要求1-4中任一项所述的通式（I)所示的化合物的制备方法，由W下方法制备得 到：步骤a:化合物A与N-漠代下二酷亚胺反应得到化合物B; 步骤b:化合物B与叔下基亚横酷胺反应得到化合物C; 步骤C:用棚氨化钢还原化合物C得到化合物D; 步骤d:化合物D与漠代烘反应得到化合物E; 步骤e:化合物E与Ξ光气反应得到化合物F; 步骤f:化合物F与叠氮物反应得到G; 步骤g:化合物G与3，5-二甲基异恶挫-4-棚酸频哪醇醋反应得到化合Η; 步骤h:化合物Η与舰代烧反应得到通式(I)表示的化合物； 其中，Ri、R2和η的定义如上所述。6. 权利要求1-4中任一项所述的通式（I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备 治疗与bromodomain结构域蛋白相关疾病的药物中的用途。7. 权利要求1-4中任一项所述的通式（I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备 治疗肿瘤的药物中的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述肿瘤可为但不限于多发性骨髓瘤、胃癌、肺 癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝细 胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或膜腺癌。9. 一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种根据权利要求1-4中任一项所述 的通式（I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，W及药学上可接受的辅料。
【专利摘要】本发明涉及三氮唑衍生物制备方法及其在医药上的应用。具体而言，本发明涉及一种通式(I)所示的三氮唑衍生物及其可药用的盐或含有其的药物组合物、及其制备方法，本发明进一步涉及所述三氮唑衍生物及其可药用的盐或含有其的药物组合物作为BET抑制剂在治疗多种肿瘤中的用途，其中通式(I)的各取代基同说明书中的定义相同。
【IPC分类】A61P35/00, C07D413/14, A61P35/02
【公开号】CN105541825
【申请号】CN201511016420
【发明人】张惠斌, 周金培, 赵雷磊, 张兵, 徐斌, 韩丽, 杨一飞
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月28日