支原体td-pcr检测方法及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物领域，特别是设及支原体的TD-PCR(降落聚合酶链式反应)检测方 法及其引物。
【背景技术】
[0002] 支原体是哺乳动物细胞培养过程中的主要污染源，它能够干扰细胞的功能，是困 扰实验室及工业生产的主要问题。哺乳动物细胞广泛应用于生产治疗性生物制品，因此需 对其进行支原体检查W确保产品的纯度及安全性。污染细胞最常见的支原体包括:发酵支 原体(M.fementans)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体 (M.arginina)、唾液支原体(M. salivarium)和人型支原体(M.hominis)。被运些支原体污染 的细胞常常不引起明显的细胞病变，也不导致培养液浑浊，难W凭肉眼发现，因此，建立一 种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。
[0003] 《美国药典/国家处方集》中明确规定了两种检测支原体的方法。其中，培养法需要 将细胞样本直接培养到固体及液体培养基当中来扩增培养。为了检测一些无法培养的支原 体，样本还需被接种到指示细胞当中通过后续DNA染色检测。培养法检测周期长(28天），检 测成本高，一些治疗细胞的生命周期较短，无法用此方法检测。
[0004] 多聚酶链式反应(PCR)相对于传统培养法检测支原体具有更加快速经济的优点。 一些PCR引物能够特异性扩增支原体保守序列，并检测绝大部分的支原体，因而PCR法被广 泛用于临床W及实验室细胞及组织支原体的检测。然而PCR法的灵敏性及特异性是其被接 受成为生物医药检测方法的最大障碍。尽管PCR法十分灵敏，能够检测1-10个拷贝值的支原 体DNA，但在哺乳动物细胞的支原体检测中却并不灵敏，检测限大约为1000c化/ml,超过了 培养法的检测限。虽然细胞培养中支原体的感染水平一般为1〇7-1〇8,但低水平的支原体感 染用PCR法检测易出现假阴性结果。
[0005] 另外，支原体DNA的提取，目前常用的方法是用苯酪氯仿抽提DNA，运种方法的缺点 是：1、抽提过程较为复杂繁琐;2、苯酪、氯仿对环境及人体的危害性较大;3、时间较长，一般 需两至Ξ天。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种支原体TD-PCR检测方法，它可W提高 PCR法检测支原体的灵敏度和准确性。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的支原体TD-PCR检测方法，步骤包括：
[000引1)抽提待测样品DNA;
[0009] 2)采用TD-PCR方法检测待测样品DNA中是否含有支原体。
[0010]较佳的，步骤1)，采用Qiagen试剂盒提取待测样品DNA，抽提方法为：用500化PBS 重悬样本，加入50化蛋白酶K，满旋混匀，再加入50化L Buffer AL裂解液，满旋混匀，在56°C 下解育30分钟，加入11化L 3M醋酸铅，223化L纯乙醇，在-20°C~-30°C下沉淀DNA60min，再 在2-8°C下离屯、eOminW上，离屯、力leOOOgW上，用500μΙ 75%的乙醇清洗DNA沉淀，用焦碳 酸二乙醋将沉淀的DNA重悬成0.化g/μΙ DNA溶液。
[0011] 步骤1)，所述TD-PCR方法的PCR反应体系包括:PCR反应体系包括:DEPC水，不含 MgCb或dNTPs的10 X缓冲液，50mM MgCb溶液，lOmM dNTPs，20μΜ正向引物，20μΜ反向引物， 5υ/μ1 Platiη咖叫aq DNA聚合酶，共40μ1。PCR反应条件为：94°C融链；70-60°C退火；72°C延 伸。
[0012] 本发明要解决的技术问题之二是提供用于上述方法的引物对。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明的引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物 具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO.2所示的序 列或其互补序列。
[0014] 本发明利用改进后的QIAGEN试剂盒抽提DNA，再通过TD-PCR方法检测支原体，相比 现有的支原体检测方法，不仅缩短了检测时间，而且增加了检测的特异性和稳定性，同时还 减少了实验过程中有毒有害试剂对于人体及环境的危害，将该方法用于生物制品的放行检 巧。，检测周期可W由原来的28天降为1~2天，大大缩短了检测周期。
【附图说明】
[001引图1是用改进的QIAGEN试剂盒抽提样本DNA的流程示意图。
【具体实施方式】
[0016]为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发 明详述如下：
[0017] 实施例1
[0018] 本实施例的支原体TD-PCR检测方法，具体包括W下步骤：
[0019] 1.抽提样本DNA
[0020] 本实施例采用改良的QIAGEN试剂盒抽提方法抽提样本DNA，运种方法省去了苯酪 氯仿方法反复抽提DNA的步骤，在裂解液Buffer AL高效裂解细胞后，通过助沉淀剂醋酸铅， 并在低溫助沉淀作用下，极大的提高了支原体DNA的获得率。具体抽提步骤为：
[0021] 用50化L PBS(憐酸盐缓冲液)重悬样本，加入50化蛋白酶K(Qiagen)，满旋混匀，再 加入500μΙ Buff er AL(裂解液，Qiagen)，满旋混匀，在56°C下解育30分钟。然后，加入11化L 3M醋酸铅，2 2：34化的纯乙醇，在-20 °C~-30 °C下沉淀DNA 6Omiη W上，再在2-8 °C下离屯、 60minW上，离屯、力大于leOOOg。用50化L 75%的乙醇清洗DNA沉淀两次。用一定体积的DEPC (焦碳酸二乙醋)将沉淀的DNA重悬成0.化g/化DNA溶液(如果DNA抽提后，浓度小于0.化g/μ L，则后续PCR扩增时，每个PCR反应管中需加入化L最大浓度的DNA溶液）。
[0022] 2.PCR 扩增
[0023] PCR反应的引物为：
[0024] 正向引物:GGCGAATGGGTGAGTAACACG(SEQ ID N0.1)
[0025] 反向引物:CGGATAACGTTGCGACCTATG(SEQ ID N0.2)
[0026] PCR反应试剂包括:DEPC水，10 X缓冲液（不含MgCl2或dNTPs)，50mM MgCb溶液， lOmM dNTPs，正向引物20μΜ，反向引物20μΜ，5υ/μ1 P Lati num? Taq DNA聚合酶，共40μ1。
[0027] PCR 扩增：
[0028] 在4个PCR反应管中加入待测样本DNA，其中3管不再加入其它DNA，第4管中再加入 10个拷贝数或菌落活性单位的支原体DNA。
[0029] 做3管试剂对照，第1管只加入所有PCR反应试剂，第2管加入所有PCR反应试剂和10 个拷贝数或菌落活性单位的支原体DNA，第3管加入所有PCR反应试剂和100个拷贝数或菌落 活性单位的支原体DNA。
[0030] 在第1个PCR反应管中加入人源性朋DNA或C册DNA作为阴性对照，在第2管中加入 人源性H9DNA或C册DNA和10个拷贝数或菌落活性单位的支原体DNA，在第3管中加入人源性 H9DNA或C册DNA和100个拷贝数或菌落活性单位的支原体DNA。
[0031] 运用降落PCR扩增，PCR反应条件为：94°C融链;70-60°C退火;72°C延伸。扩增产物 通过凝胶电泳分离并在紫外光下检测。
[0032] 检测结果必须同时满足如下有效性评判准则：1)10个和100个基因拷贝数或菌落 活性单位的支原体DNA加入标准的H9细胞DNA或C册细胞DNA后，gel red染色凝胶和Flash凝 胶电泳结果为阳性且产物大小正确(大小为438-46化P，根据支原体菌株不同而不同）；2)试 剂对照PCR扩增后的凝胶电泳结果必须为阴性;3)阴性对照PCR扩增后的凝胶电泳结果必须 为阴性。如果满足上述有效性评判准则，可进一步评估检测样本。若测试样品PCR扩增后3个 重复均为阴性，实验结果判断为阴性;若测试样品PCR扩增后3个重复中有2-3个能够检测到 大小为(438-470bp)的阳性条带，实验结果判断为阳性;若测试样品PCR扩增后3个重复中的 1个能够检测到阳性条带，实验结果为不确定，实验将会重做或/和调查W获得明确的结果。
[0033] 实施例2检测限验证
[0034] 根据欧洲药典5.8章2.6.7的要求，核酸提取方法必须能够达到10C即/ML的检测限 才能成为培养法的替代检测方法。按照支原体作为污染源出现的概率及动植物种类史，欧 洲药典对于核酸提取方法的检测限验证推荐了9种支原体。其中，莱氏无胆酱原体 (Achol邱lasma laidlawii)为人用及兽用疫苗生产过程中必须检测的支原体，人型支原体 (Mycoplasma hyorhinis)为非鸟类疫苗必须检测的支原体，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、发酵支原体(Mycoplasma fe;rmen1:ans)为人用疫苗必须检测的支原体，精氨 酸支原体(Mycoplasma A巧inine)核酸比率较低，检测难度为最高。由于本方法的PCR扩增 部分已经在药明康德（费城)做过详实的验证实验，本验证将作为其转移验证开展对W下五 种常见支原体进行检测限验证:肺炎支原体、莱氏无胆酱原体、发酵支原体、人型支原体、精 氨酸支原体。其中，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)来源于药明康德美国费城实验 室，莱氏无胆酱原体、发酵支原体、人型支原体、精氨酸支原体来源于美国菌种保藏中屯、 (ATCC)。将上述五种支原体稀释至浓度为100cfu/ml、10cfu/ml及5cfu/ml，取1ml，由Ξ名实 验人员各自用实施例1的方法，通过改良QIAGEN试剂盒方法抽提DNA后，分别用降落PCR扩 增，最终获得该方法的检测限为lOcfu/mL。
【主权项】
1. 支原体TD-PCR检测方法，其特征在于，步骤包括： 1) 抽提待测样品DNA; 2) 采用TD-PCR方法检测待测样品DNA中是否含有支原体。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1 )，采用Qiagen试剂盒提取待测样品 DNA。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1 )，DNA抽提方法为：用50化L PBS重悬 样本，加入50化蛋白酶K，满旋混匀，再加入50化L Buffer AL裂解液，满旋混匀，在56 °C下解 育30分钟，加入11化L 3M醋酸铅，223化L纯乙醇，在-20°C~-30°C下沉淀DNASOmin，再在2-8 °C下离屯、60minW上，离屯、力ieOOOgW上，用50化L 75%的乙醇清洗DNA沉淀，用焦碳酸二乙 醋将沉淀的DNA重悬成0.化g/化DNA溶液。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，PCR反应体系包括:DEPC水，不含 MgCb或dNTPs的10 X缓冲液，50mM MgCb溶液，IOmM dNTPs，20咖正向引物，20測反向引物， 抓AUP UtInum^aq DNA聚合酶，共40iil。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，PCR反应条件为:94°C融链;70-60 。(:退火;72°C延伸。6. 用于权利要求1至5任一项所述方法的引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引 物，所述正向引物具有如SEQ ID NO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO.2所示的序列或其互补序列。
【专利摘要】本发明公开了一种支原体TD-PCR检测方法，步骤包括：1)抽提待测样品DNA；2)采用TD-PCR方法检测待测样品DNA中是否含有支原体。本发明还公开用于上述检测方法的引物对。本发明通过TD-PCR方法检测支原体，相比现有的支原体检测方法，不仅缩短了检测时间，而且增加了检测的特异性和稳定性，同时还减少了实验过程中有毒有害试剂对于人体及环境的危害。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/04, C12N15/11, C12R1/35, C12Q1/68
【公开号】CN105586421
【申请号】CN201610091494
【发明人】魏良君, 贾明媚, 唐苏
【申请人】苏州药明康德检测检验有限责任公司, 无锡药明康德生物技术股份有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年2月19日