专利名称：银杏防御素、编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种银杏防御素、其编码基因与应用。
背景技术：
1985年美国科学家Lehrer等从人的嗜中性白细胞分离纯化出3种阳离子小肽， HNP-U HNP-2与HNP-3，通过色谱、电泳与功能分析，将它们与以前从兔、豚鼠分离的同类小肽一起命名为防御素。后来发现这类小肽普遍存在于高等生物中，对病原微生物具有广谱的毒杀效应，是高等生物防御病原体入侵的重要防御物质。目前所知，防御素(defensins)是一类分子量很小(一般15-30残基)，富含半胱氨酸的阳离子蛋白质，属于抗微生物肽的一类。存在于脊椎动物、无脊椎动物和植物等生物类群中。防御素有很强的抗细菌、真菌和具囊膜病毒的作用。虽然目前对防御素的抑菌机理尚无明确的定论，流行的观点是带正电的防御素与带负电的细菌细胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的离子通道，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态， 导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量下降，最终使靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。正是由于这种特殊的作用机理，使防御素具备两个特点一是抗性谱广，二是目的微生物难以对防御素产生抗性突变。这就是科学家们对其应用前景看好的重要依据。银杏(Ginkgo bilcAa)，又名白果、公孙树，是现存裸子植物中最古老的遗植物之一，人称“活化石”。银杏从栽种到结果要二十多年，四十年后才能大量结果，能活到一千多岁，是树中的老寿星。银杏种子营养丰富，具有天然保健作用，长期食用能够延缓衰老，益寿延年，在宋代被列为皇家贡品。自然界中银杏树几乎不会感染疾病，研究者们围绕这种特殊的植物进行了大量的研究。例如，Huang等Q000)已经从银杏叶子中分离纯化得到一种几丁质结合蛋白，Sien 等000 从银杏中克隆到一种茉莉酮酸酯依赖的防御素基因。Wang等Q000)从银杏果仁中分离出一种具有抑制HIV-I反转录酶活性的新抗菌蛋白。发明人通过构建CDNA文库，获得了一个新的银杏防御素基因序列，将本发明的防御素及其编码基因在数据库中搜索，没有发现任何相同序列。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种银杏防御素。本发明的第二个目的在于提供本发明银杏防御素的编码基因。本发明的第三个目的在于将本发明的银杏防御素应用于制备抗病菌类产品。本发明所选择的银杏(Ginkgo biloba)采自中国江苏新沂。本发明用构建cDNA文库的方法，从中国江苏新沂银杏果仁克隆得到防御素家族成员。
银杏果仁cDNA文库的构建首先分离银杏果仁，提取总RNA。取总RNA进行反转录 合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液， 从平板上挑取单克隆保种。本发明通过对以上重组克隆大规模序列測定，得到6条EST序列编码银杏防御素 家族成员，申请人将之命名为银杏防御素GD01，银杏防御素成熟肽由48个氨基酸組成，等 电点为9. 05，分子量为5. 43千道尔顿，银杏防御素具有典型的防御素一级结构的特征，其 氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示，具体如下 1 10203040该成熟肽可以通过分离纯化得到，HPLC鉴定其纯度达到96. 5%，MALDI-T0F鉴定
其分子量正确。本发明的银杏防御素，为如下(a)或(b)所述的多肽(a)具有序列表中SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列，即银杏防御素⑶01 ；(b)将(a)中的氨基酸序列经过个别氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具 有相同功能的由(a)衍生的多肽。上述(b)所述银杏防御素，优选银杏防御素⑶01的C末端酰胺化修饰物。本发明的银杏防御素可以是通过化学合成、基因重组表达获得的产物。编码银杏防御素H的多核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO=I所示，具体如下1 cggacgtgca aaagtcaaag ccacaagttc aaagggtatt gcttgagcga caccaattgc61 agaaatgtgt gcagaacaga gggatttggg actgggagct gtgatttcgc cagccgaaag121 tgctactgct ataaaccctg cgtt本发明的多核苷酸，为如下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)编码银杏防御素H的前体肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。本发明的多核苷酸，优选具有序列表中SEQ ID NO 1所述的核苷酸序列的多核苷酸。本发明获得的银杏防御素GDOl具有生物活性，具有抗菌作用。分离纯化的防御素 GDOl在20nM时即能抑制部分致病細菌和真菌。因此，本发明的银杏防御素可应用于制备抗 病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剤、兽药、防腐剤、医药产品如抗菌药物等。
图1为银杏防御素⑶01纯化后的MALDI-T0F鉴定图；图2为银杏防御素⑶01抑制大肠杆菌生长的实验結果。
具体实施方式
实施例一银杏果仁cDNA文库的构建及EST序列分析总RNA的提取和cDNA合成分离银杏果仁，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS 试剂说明书进行毒管总RNA提取。文库构建采用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit试剂盒，并利用试剂盒本身附带的引物、载体、限制性内切酶等进行实验。取Iug银杏果仁总RNA以SMART III寡聚核苷酸片断(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT GGCCATTATGGCCGGG-3，)和 CDSII1/3，PCR 引物(5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30 IN-3，)进行逆转录合成第一链，得到10 μ 1 cDNA第一链产物。银杏果仁cDNA文库的构建和鉴定取cDNA 1. 5 μ 1用于连接反应，反应体系 5μ1，转化其中Ιμ ，取5ul转化液分别涂板，取300ul转化液用于摇总库菌落。随机挑取单克隆进行PCR鉴定，结果显示，重组率超过95%平均插入片段长度为850bp。从平板上随机挑取六板单克隆摇菌、保种、提取质粒、T7引物单向测序，手工使用BLASTN和BLASTX在线同源比对，SEQT00L, ClustalX 1. 83程序分析测序结果。实施例二 银杏抗菌基因GDOl序列的测定和分析银杏抗菌基因gdOl的序列来自实施例一银杏果仁cDNA文库中所克隆到的6条高度同源的EST序列。利用工具软件SEQT00L对其碱基序列进行分析，并获得其最大开放读码框，长度237bp (不包含终止密码子)，编码79个氨基酸残基的前体肽。我们通过高效液相色谱从果仁提取物中另外分离纯化了与该基因序列对应的成熟肽序列，其成熟肽核苷酸序列对应为序列表中SEQ ID NO 1所述，成熟肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所述。实施例三银杏防御素⑶01的分离纯化将50g银杏种仁在室温下研磨成糊状，加入IOOmL提取缓冲液，通过40%及80% (NH4)2S04分级盐析，CM Sephorose F. F.离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析，以萃取缓冲液洗脱，215nm和^Onm在线检测，可见三个紫外吸收峰，收集第1峰上C18反相柱分离，乙腈梯度洗脱，可分离纯化到一个单一峰。经飞行时间质谱分析，分子量为道尔顿(图1)，这与根据所克隆的基因推测的表达序列的理论分子量(考虑到四对二硫键)一致。采用N-端测序进一步证实了该序列为银杏抗菌GD01。实施例四银杏防御素GDOl的抑菌活性实验在96孔板每个孔加入空白肉汤100 μ 1 (除第一孔外)。根据设计的实验浓度，在第一列加入200 μ 1待测样品5ug/ml防御素⑶01，吸取100 μ 1至第二孔，上下吹打，混合均勻后吸取100 μ 1至第三孔，最后100 μ 1弃去。这样每孔对应的体积分数为1，0.5，0.25。 做三个平行。最后在每孔中加入100 μ 1稀释好的菌液，放入恒温培养箱中过夜培养。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。结果显示，对照管中有大量细菌生长，加入防御素 ⑶01的孔中，1 1的孔中完全没有细菌生长(图2)。本发明的银杏防御素GDOl能抑制部分致病细菌和真菌。因此，本发明的银杏防御素可应用于制备抗病菌类产品，如饲料添加剂、兽药、防腐剂、抗菌药物等。
权利要求
1.一种银杏防御素，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的银杏防御素，其特征在于为1所述多肽的个别氨基酸取代或修饰而得到的功能等同物多肽。
3.一种多核苷酸，为如下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)编码权利要求1、2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.权利要求1或2所述的银杏防御素在制备抗病菌类产品上的应用，所述抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂和医药产品。
全文摘要
本发明为一种银杏防御素及其编码基因与应用。本发明的银杏防御素为银杏防御素GD01，或其保守性变异多肽，或其活性衍生物，或经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的银杏防御素GD01衍生的多肽。本发明的银杏防御素的成熟肽具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。本发明的银杏防御素应用于制备抗病菌类产品，如饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品等。
文档编号A23K1/16GK102286084SQ20101020668
公开日2011年12月21日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者汪猜, 皮灿辉 申请人:广州和仕康生物技术有限公司